Blue/Clear 非變性凝膠電(diàn)泳試劑盒（手灌膠）
Blue/Clear Native PAGE Electrophoresis Kit Ver.731072
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貨号
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名稱
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包裝
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RTD6140
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Blue/Clear 非變性凝膠電(diàn)泳試劑盒(手灌膠)
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10 次
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● 貨品内容：
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組份
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貨号
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名稱
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規格
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保存
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1
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RTD6140-01
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2×BN/CN凝膠緩沖液
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40 ml
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4℃
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2
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AC2914-30ml
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40%
PAA（29:1）
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30 ml
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4℃
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2
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BC500P
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10×BN/CN PAGE電(diàn)泳緩沖液(幹粉)
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500 ml
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RT
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3
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PL114-01
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4×BN/CN-PAGE蛋白(bái)上(shàng)樣緩沖液
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1 ml
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-20℃
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4
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BC270
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2% G-250染料（電(diàn)泳用）
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20 ml
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4℃
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5
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BC260-01
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5% G-250染料（上(shàng)樣用）
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1 ml
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4℃
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6
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SR0510
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濃縮膠紅(hóng)色添加染料(200×)
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0.5 ml
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RT
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7
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AP020P
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APS（幹粉）
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0.5 g
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RT(配制後-20℃貯存)
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8
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TA0761
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TEMED
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0.5 ml
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4℃ 避光(guāng)
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9
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說明書
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一(yī)份
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● 産品簡介：
Blue/Clear Native PAGE（BN/CN-PAGE）是一(yī)種從(cóng)生(shēng)物(wù)樣品（質膜，胞漿等）中分離分子量10 kD-10 M kD 範圍的蛋白(bái)質複合物(wù)的電(diàn)泳技(jì)術(shù)。其原理是用溫和去污劑(如 DDM，digitonin)将蛋白(bái)複合體從(cóng)細胞膜中以近似天然的狀态分離出來，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是用考馬斯亮藍 G-250 代替 SDS與蛋白(bái)結合而使其帶負電(diàn)荷，根據蛋白(bái)分子量不同在 PAGE膠中得到(dào)分離；Clear Native PAGE（CN-PAGE）是電(diàn)泳緩沖液中不加入任何染料，電(diàn)泳中始終保持蛋白(bái)的天然電(diàn)荷和活性狀态，然而，其蛋白(bái)的分辨率要低(dī)于Blue Native PAGE。另外，BN-PAGE由于考馬斯亮藍G-250存在，使蛋白(bái)都覆蓋上(shàng)負電(diàn)荷，可以分離堿性蛋白(bái)（pI＞7）和酸性蛋白(bái)(pI＜7)；而CN-PAGE隻适合于酸性蛋白(bái)（pI＜7）的分離。
本産品包括BN/CN-PAGE制膠的所有成分，方便使用。可以用于分離分子量在 10 kD-500 kD 的蛋白(bái)複合體，樣品可以來于胞漿、細胞總裂解液、細胞膜、線粒體膜和葉綠體膜等。電(diàn)泳後可直接用于考染、銀(yín)染、Western 雜(zá)交、SDS-PAGE電(diàn)泳、蛋白(bái)純化、蛋白(bái)活性檢測等分析實驗，也可直接用于電(diàn)洗脫制備蛋白(bái)。
試劑盒配套有紅(hóng)色濃縮膠添加染料,凝固後的濃縮膠為(wèi)紅(hóng)色,有利于在藍色電(diàn)泳緩沖液中觀察加樣孔,方便上(shàng)樣。
本試劑盒大約可以配制8-25塊常規大小(xiǎo)（8×10 cm）PAGE凝膠，具體數量根據凝膠濃度和厚度決定，1 mm厚度8%凝膠可以配制至少10塊膠。
● 運輸和貯存：
本産品常溫運輸；組份按照(zhào)标簽溫度貯存；有效期一(yī)年(nián)。
● 使用說明：
一(yī). 樣品制備：
該試劑盒不含樣品制備的相(xiàng)關試劑，根據樣品種類，具體選擇不同提取方法。植物(wù)類囊體BN樣品制備可以選擇植物(wù)類囊體膜提取試劑盒（貨号：RTU5002）；動物(wù)總蛋白(bái)BN樣品制備可以選擇動物(wù)胞漿活性蛋白(bái)提取試劑盒（不含去垢劑，離心柱法）（貨号：RTD8106）；動物(wù)膜蛋白(bái)BN樣品制備可以選擇動物(wù)膜蛋白(bái)提取試劑盒(細胞)（貨号：RTD8111）和動物(wù)膜蛋白(bái)提取試劑盒(組織)（貨号：RTD8112）；動物(wù)線粒體BN樣品制備可以選擇動物(wù)細胞線粒體提取試劑盒（貨号：RTD8115）和動物(wù)組織線粒體提取試劑盒（貨号：RTD8117）。
二. 制膠：
2.1 分離膠制備：
2.1.1 不同濃度的分離膠的最佳分離範圍：
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分離膠濃度
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最佳分離範圍
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6%
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80-500 kD
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8%
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50-350 kD
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10%
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20-150 kD
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12%
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15-100 kD
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15%
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10-80 kD
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2.1.2根據表一(yī)，将不同體積的成分在小(xiǎo)燒杯中混合，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡
2.1.3在凝膠模具中灌入适量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃闆頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然後在分離膠溶液上(shàng)輕輕覆蓋一(yī)層1-3 cm的水(shuǐ)層，使凝膠表面保持平整。
2.1.4靜(jìng)置15-30分鍾，待分離膠和水(shuǐ)層之間出現一(yī)個(gè)清晰的界面後，說明凝膠已聚合。
注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高(gāo)時，聚合較快；冬天氣溫低(dī)時，聚合時間會(huì)延長(cháng)。可以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。
表一(yī) Blue/Clear Native PAGE分離膠配方表
（以一(yī)塊1.0 mm厚度mini膠為(wèi)例）
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分離膠總體積 5 ml
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6%
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8%
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10%
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12%
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15%
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組份
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組份加入體積（ml）
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滅菌水(shuǐ)
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1.7
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1.45
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1.2
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0.95
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0.57
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2×BN/CN凝膠緩沖液
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2.5
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2.5
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2.5
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2.5
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2.5
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40％ PAA（29:1）
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0.75
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1
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1.25
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1.5
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1.875
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10％ APS
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0.05
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0.05
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0.05
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0.05
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0.05
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TEMED
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0.005
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0.005
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0.005
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0.005
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0.005
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2.2 濃縮膠制備：
2.2.1去除覆蓋在分離膠上(shàng)的水(shuǐ)層。
2.2.2按照(zhào)表二将不同成分在一(yī)個(gè)小(xiǎo)燒杯中混合，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。
2.2.3将濃縮膠溶液加至分離膠的上(shàng)面，直至凝膠溶液到(dào)達前玻璃闆的頂端。
2.2.4将梳子插入凝膠内，避免産生(shēng)氣泡。
2.2.5靜(jìng)置30-60分鍾，等待濃縮膠聚合。
注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高(gāo)時，聚合較快；冬天氣溫低(dī)時，聚合時間會(huì)延長(cháng)。可以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。
表二 Blue/Clear Native PAGE濃縮膠（4%）配方表（以一(yī)塊1.0mm厚度mini膠為(wèi)例）
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組份
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不同凝膠體積對應各組份的取樣量
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濃縮膠總體積2 ml
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H2O
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0.8 ml
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2×BN/CN凝膠緩沖液
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1 ml
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40％ PAA（29:1）
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0.2 ml
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濃縮膠紅(hóng)色添加染料(200×)
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10 μl
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10％ APS
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20 μl
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TEMED
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2 μl
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三. 電(diàn)泳：
3.1 準備電(diàn)泳緩沖液：
将10×BN/CN PAGE電(diàn)泳緩沖液（幹粉）溶于500 ml滅菌水(shuǐ)中，徹底溶解，測定pH應為(wèi)7.0左右，不要調節pH。用前稀釋10倍即配成1×BN/CN PAGE電(diàn)泳緩沖液。
3.1.1 CN-PAGE電(diàn)泳：
陽極緩沖液和陰極緩沖液均直接使用1×BN/CN PAGE電(diàn)泳緩沖液進行電(diàn)泳。
3.1.2 BN-PAGE電(diàn)泳：
陽極緩沖液(外槽)使用1×BN/CN PAGE電(diàn)泳緩沖液，陰極緩沖液(内槽)按照(zhào)下(xià)表配制：
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1×藍色陰極緩沖液
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150 ml
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10×BN/CN PAGE電(diàn)泳緩沖液
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15
ml
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2% G-250 染料（電(diàn)泳用）
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1.5 ml
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超純水(shuǐ)
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定容至150
ml
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3.2 準備樣品：
3.2.1 CN-PAGE電(diàn)泳：
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總體積
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10
μl
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蛋白(bái)樣品
|
x μl
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4×BN/CN-PAGE蛋白(bái)上(shàng)樣緩沖液
|
2.5 μl
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超純水(shuǐ)
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補至10 μl
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不要加熱
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3.2.2 BN-PAGE電(diàn)泳：
3.2.2.1
植物(wù)類囊體膜蛋白(bái)電(diàn)泳：
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總體積
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10
μl
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|
|
含去垢劑樣品*
|
|
植物(wù)類囊體膜蛋白(bái)樣品
（2%DDM增溶）
|
x μl
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4×BN/CN-PAGE蛋白(bái)上(shàng)樣緩沖液
|
2.5 μl
|
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5%
G-250染料（蛋白(bái)上(shàng)樣）
|
1 μl
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超純水(shuǐ)
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補至10 μl
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不要加熱
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*植物(wù)類囊體膜蛋白(bái)電(diàn)泳中，含去垢劑樣品中染料加入按照(zhào)以下(xià)原則：
植物(wù)類囊體樣品中G250終濃度為(wèi)去垢劑終濃度的1/4。例如樣品中DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM， n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）終濃度為(wèi)2%，則需要G-250終濃度為(wèi)0.5%。10 μl蛋白(bái)樣品中需要加5%
G-250染料1 μl。
3.2.2.2
動物(wù)線粒體BN樣品電(diàn)泳：
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總體積
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10
μl
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含去垢劑樣品*
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動物(wù)線粒體BN樣品
（1%DDM增溶）
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x μl
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4×BN/CN-PAGE蛋白(bái)上(shàng)樣緩沖液
|
2.5 μl
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5%
G-250染料（蛋白(bái)上(shàng)樣）
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0.25 μl
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超純水(shuǐ)
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補至10 μl
|
|
|
不要加熱
|
*動物(wù)線粒體BN樣品電(diàn)泳中，含去垢劑樣品中染料加入按照(zhào)以下(xià)原則：
動物(wù)線粒體BN樣品中G250終濃度為(wèi)去垢劑終濃度的1/8。例如樣品中DDM終濃度為(wèi)1%，則需要G-250終濃度為(wèi)0.125%。10 μl蛋白(bái)樣品中需要加5% G-250染料0.25 μl。
3.2.2.3
不含去垢劑樣品：
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總體積
|
10
μl
|
|
不含去垢劑樣品
|
x μl
|
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4×BN/CN-PAGE蛋白(bái)上(shàng)樣緩沖液
|
2.5 μl
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5%
G-250染料（蛋白(bái)上(shàng)樣）
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- #
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超純水(shuǐ)
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補至10 μl
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不要加熱
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# 不含去垢劑樣品可以不必添加5%G-250染料。
3.3電(diàn)泳過程；
3.3.1 CN-PAGE電(diàn)泳：
電(diàn)泳内外槽均使用1×BN/CN PAGE電(diàn)泳緩沖液。在電(diàn)泳槽的内槽内加入1×BN/CN PAGE電(diàn)泳緩沖液(讓電(diàn)泳緩沖液漫過加樣孔)，輕輕撥出預制膠梳子，用1ml吸頭沖洗加樣孔3次，随後在電(diàn)泳槽外槽加入适量的1×BN/CN PAGE電(diàn)泳緩沖液。
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CN-PAGE電(diàn)泳
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恒電(diàn)壓
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起始電(diàn)流
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結束電(diàn)流
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電(diàn)泳時間
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120V
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10-15mA/闆膠
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4-10mA/闆膠
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50+min
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注：冰浴電(diàn)泳
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3.3.2 BN-PAGE電(diàn)泳：
BN-PAGE電(diàn)泳外槽使用1×BN/CN電(diàn)泳緩沖液；内槽開(kāi)始電(diàn)泳使用的是1×藍色陰極緩沖液，冰浴電(diàn)泳，等待電(diàn)泳指示前沿到(dào)達距離凝膠頂部2/3處時，将電(diàn)泳緩沖液更換為(wèi)1×BN/CN電(diàn)泳緩沖液，繼續後續電(diàn)泳，因為(wèi)過多(duō)染料會(huì)影響蛋白(bái)在凝膠中的遷移以及蛋白(bái)後續的轉膜實驗。
BN-PAGE電(diàn)泳條件(jiàn)（一(yī)闆膠）
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恒電(diàn)壓
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起始電(diàn)流
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電(diàn)泳時間
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緩沖液
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120 V
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8-15 mA
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20-25
min
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1×藍色陰極緩沖液
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冰浴電(diàn)泳
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指示前沿至凝膠頂部三分之二處，更換内槽緩沖液為(wèi)無色1×BN/CN
電(diàn)泳緩沖液
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恒電(diàn)壓
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繼續電(diàn)泳時間
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結束電(diàn)流
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緩沖液
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120 V
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45 min
+
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3-5 mA
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1×BN/CN電(diàn)泳緩沖液
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冰浴電(diàn)泳
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四. 轉膜：
BN-PAGE轉膜必須用PVDF膜，不能(néng)用NC膜，因為(wèi)NC膜與G-250結合非常緊密。
轉膜緩沖液可以使用10×BN轉膜緩沖液（貨号：BC600P）。
五. 染色：
5.1 将電(diàn)泳後的PAGE膠取下(xià)放(fàng)入塑料容器(qì)中，加入适量FastBlue蛋白(bái)染色液（以剛剛覆蓋過膠面為(wèi)适），條帶1-2分鍾即可見(jiàn)。
5.2 搖床常溫搖動10-15分鍾至條帶清晰可見(jiàn)。
5.3 加入适量蒸餾水(shuǐ)脫色，期間更換1-2次蒸餾水(shuǐ)，搖床常溫搖動10-15分鍾至背景幹淨。
5.4 觀察保存結果。
六. 實驗示例：
RTD6140 Blue/Clear 非變性凝膠電(diàn)泳試劑盒（手灌膠） WB檢測
樣品處理：K562懸浮細胞提取胞漿活性蛋白(bái)（貨号：RTD6106 動物(wù)活性蛋白(bái)提取試劑盒（不含去垢劑））
4×BN/CN-PAGE蛋白(bái)上(shàng)樣緩沖液（貨号：PL114） 調整蛋白(bái)濃度為(wèi)1μg/μl上(shàng)樣液，梯度上(shàng)樣5-20μg
電(diàn)泳：8% BN手灌膠，穩壓200V 1×藍色陰極緩沖液至指示前沿距離膠上(shàng)沿2/3處，
更換為(wèi)無色1×BN/CN PAGE電(diàn)泳緩沖液，電(diàn)泳時間共83分鍾
轉膜：0.45 μm PVDF膜，10×BN轉膜緩沖液（貨号：BC600P）稀釋為(wèi)1×BN轉膜緩沖液加20%甲醇，
恒流200mA 2小(xiǎo)時，未冰浴。
轉膜效果檢測：膜用麗春紅(hóng)染色液染色（貨号：RTD6301）有可見(jiàn)條帶，膠用FastBlue蛋白(bái)染色液染色
（貨号：RTD6202）幾乎無條帶，證明轉膜成功。膜用無水(shuǐ)甲醇清洗5分鍾去除膜上(shàng)藍色殘餘。
封閉：Western快速封閉液（貨号：WR5020） RT 封閉10 分鍾；
一(yī)抗：兔單抗GAPDH 1:10000 RT 60min；二抗：羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min，
ECL檢測：RealECL發光(guāng)液（貨号：EC2520），曝光(guāng)1秒(miǎo)。
使用RTD6140
Blue/Clear 非變性凝膠電(diàn)泳試劑盒（手灌膠）産品發表部分文章列表：
1.
[2022 IF=2.9] Identification and structural analysis of
dimeric chicken complement
component 3d and its binding with
chicken complement receptor 2.
Author: Huan Jin, Min Tu, Zhaoying Meng, Bo Jiang,
Qianqian Yang, Yongqing Li,Zhenhua Zhang
Journal: Developmental and Comparative Immunology 152
(2024) 105109
Institution: Institute
of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Academy of Agriculture and
Forestry Sciences
Paper link：https://doi.org/10.1016/j.dci.2023.105109