柱式動物(wù)胞漿蛋白(bái)提取試劑盒(細胞樣品,非變性提取,不含去垢劑)
(Column Animal
Cells Native Protein Extraction Kit，Detergent-free)
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貨号
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名稱
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規格
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RTD8106
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柱式動物(wù)胞漿蛋白(bái)提取試劑盒(細胞樣品,非變性提取,不含去垢劑)
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50次
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● 産品簡介
蛋白(bái)提取過程中經常使用去垢劑裂解細胞，如NP-40，Triton
X-100，SDS等。然而這些去垢劑會(huì)對提取的蛋白(bái)後續功能(néng)研究産生(shēng)影響。如去垢劑會(huì)影響蛋白(bái)的熒光(guāng)标記；高(gāo)濃度的去垢劑會(huì)影響蛋白(bái)互作研究；陰離子去垢劑如SDS提取得到(dào)變性蛋白(bái)，不利于蛋白(bái)活性研究；含去垢劑的蛋白(bái)樣品能(néng)與考馬斯亮藍G-250結合，影響Blue
Native電(diàn)泳的分離效果。
本試劑盒采用不含去垢劑的裂解緩沖液，在低(dī)滲透壓條件(jiàn)下(xià)，使細胞充分膨脹，然後結合離心柱離心，有效破壞細胞膜，釋放(fàng)出細胞内蛋白(bái)，然後通(tōng)過離心得到(dào)活性蛋白(bái)。另外，裂解緩沖液中也不含有還(hái)原劑如DTT和BME等，能(néng)有效保持蛋白(bái)的天然結構。
對于細胞樣品，如果每個(gè)樣品的數量為(wèi)5×106個(gè)細胞，本試劑盒可以抽提50個(gè)樣品。
使用該産品提取的蛋白(bái)可以用于普通(tōng)非變性電(diàn)泳（Laemmli系統）（貨号：RTD6130，RTD6135）或Blue
Native系統（貨号：RTD6140）。
注：由于提取緩沖液的适用性，本試劑盒主要提取得到(dào)的是胞漿内的可溶性蛋白(bái)，對細胞膜蛋白(bái)，細胞器(qì)蛋白(bái)，細胞核蛋白(bái)提取效率不高(gāo)，不建議使用。
● 産品組成
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産品編号
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名稱
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規格
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貯存
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RTD8106-01
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非變性裂解緩沖液
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25 ml
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4℃
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CD-50
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離心柱套裝
（包含離心柱和2ml連蓋收集管）
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50個(gè)
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RT
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● 貯存、效期及運輸：
按照(zhào)标簽溫度貯存；有效期一(yī)年(nián)；常溫運輸。
● 用前必讀(dú)：
1.
離心機(jī)請調整成RCF/g模式，按照(zhào)離心力設置離心機(jī)（不要根據轉速rpm模式設置），所有離心步驟都需要在4℃低(dī)溫離心機(jī)中進行。
2.
溶液混勻後放(fàng)置于冰上(shàng)。将離心柱套入2
ml連蓋收集管中，蓋好管蓋，放(fàng)置于冰上(shàng)預冷。
3.
蛋白(bái)提取推薦添加蛋白(bái)酶抑制劑（自(zì)備，試劑盒不提供），根據蛋白(bái)酶抑制劑母液濃度提前添加在裂解緩沖液中（添加時按照(zhào)1:100添加，即1ml裂解緩沖液 添加10
μl抑制劑）。研究蛋白(bái)磷酸化，需要添加磷酸酶抑制劑（自(zì)備，試劑盒不提供）。
4.
蛋白(bái)定量推薦使用BCA方法，可以選擇BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒（貨号：RTP7102）。
● 使用方法：
一(yī) 培養細胞活性蛋白(bái)提取：
1.1 即用型裂解緩沖液配制：
取适當體積的預冷裂解緩沖液，在使用前數分鍾内加入1/100體積的蛋白(bái)酶抑制劑（100×）（自(zì)備，試劑盒不提供），如果進行蛋白(bái)磷酸化研究，需要加入1/100體積的磷酸酶抑制劑（100×）（自(zì)備，試劑盒不提供），随後立即放(fàng)于冰上(shàng)待用（30分鍾内使用）。
按照(zhào)下(xià)表大體估算(suàn)裂解緩沖液使用體積：
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細胞類型
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培養器(qì)皿
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細胞數量
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細胞沉澱體積（PCV）（μl）
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裂解緩沖液（μl）
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懸浮細胞
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2-5×106
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20-50
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200
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5-10×106
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＞50
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500
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貼壁細胞
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96孔闆
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~1×105
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調整細胞數目到(dào)2-5×106
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200
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24孔闆
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~5×105
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調整細胞數目到(dào)2-5×106
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200
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6孔闆
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~2.5×106
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~25
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200
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25cm2培養瓶
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~2×106
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~20
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200
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75cm2培養瓶
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~8×106
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~80
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500
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35
mm培養皿
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~2×106
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~20
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200
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60
mm培養皿
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~5×106
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~50
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500
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100
mm培養皿
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~1.5×107
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調整細胞數目到(dào)2-5×106
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200
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注：
(二百萬，2×106)HeLa細胞，其細胞沉澱體積（PCV，Packed Cell Volume）大約為(wèi)20 μl。
1.2 準備細胞：
1.2.1
對于貼壁細胞：細胞用PBS漂洗一(yī)遍，棄PBS；再加入适量PBS，用細胞刮刀刮下(xià)細胞，或用0.02%
EDTA（0.5
mM）溶液處理細胞使細胞不再貼壁很緊，并用移液器(qì)吹打下(xià)細胞。400
g（~2000
rpm）
4℃離心5
min收集細胞，盡最大努力吸盡上(shàng)清，留下(xià)細胞沉澱備用。盡量避免用胰酶消化細胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白(bái)。
1.2.2
對于懸浮細胞：400
g（~2000
rpm）4℃離心5
min收集細胞，用PBS洗一(yī)遍，離心收集細胞，盡最大努力吸盡上(shàng)清，留下(xià)細胞沉澱備用。
1.3 裂解細胞膜：
1.3.1細胞沉澱中加入準備好的裂解緩沖液（含蛋白(bái)酶抑制劑），用移液器(qì)吹打重懸細胞沉澱，渦旋劇烈震蕩30-60秒(miǎo)，冰浴處理10分鍾，間歇2-3次混勻。
注：裂解緩沖液使用推薦經驗值：起始細胞數低(dī)于5×106加入
200 μl 裂解緩沖液，起始細胞數在5×106-1×107之間加入500
μl。如果細胞數目低(dī)于1×106或高(gāo)于1×107，建議調整細胞數目在2-5×106範圍内。
1.3.2
将細胞懸液轉移到(dào)離心柱中，蓋上(shàng)管蓋，16,000
g（~13000
rpm）
4℃離心1分鍾，離心後可見(jiàn)收集管底部有沉澱形成。
注：離心柱最大體積為(wèi)600 μl；确保離心機(jī)轉速可以在1分鍾内升速到(dào)16000 g。
1.3.3 棄去離心柱，蓋好2 ml收集管管蓋，用1ml移液器(qì)輕柔吹打重懸收集管中的沉澱。
1.4 去除細胞核和未破碎的細胞：
将懸浮溶液16000 g（~13000 rpm）
4℃離心15分鍾。
1.5 收集上(shàng)清：
收集上(shàng)清即為(wèi)胞漿蛋白(bái)，其蛋白(bái)濃度約為(wèi)0.5-2 μg/μl，不同細胞略有不同。
關鍵步驟：吸取上(shàng)清時不要觸及沉澱，甚至可以丢棄部分上(shàng)清不吸取，以免上(shàng)清中污染其他蛋白(bái)。
二 實驗示例：
5×106 K562細胞，400g 3min收集，PBS漂洗一(yī)次；加500 μl 即用型提取緩沖液（含蛋白(bái)酶抑制劑），震蕩 60秒(miǎo)，冰浴10min；16000g 1min 過離心柱；重懸沉澱；4度 16000g 15 min，取上(shàng)清即為(wèi)胞漿活性蛋白(bái)。BCA測定蛋白(bái)濃度，蛋白(bái)得率2×108細胞提取蛋白(bái)量約1.5 mg。BN電(diàn)泳（右圖）：RTD6140 配制10% BN膠。使用 4×BN蛋白(bái)上(shàng)樣緩沖液（貨号：PL114）調整上(shàng)樣濃度為(wèi)0.5μg/μl。1×藍色陰極電(diàn)泳緩沖液 200V 50min，更換為(wèi)1×無色陰極緩沖液，電(diàn)泳時間共93min，FastBlue蛋白(bái)染色液染色。變性電(diàn)泳（左圖）：RealPAGE 4-18%預制膠，用RIPA提取總蛋白(bái)（RIPA-TP）做對照(zhào)樣品，使用 含BME上(shàng)樣緩沖液調整上(shàng)樣濃度為(wèi)0.5μg/μl，200V 60min，FastBlue蛋白(bái)染色液染色。