植物(wù)類囊體膜提取試劑盒         Ver.731075

● 産品簡介：

葉綠體（Chloroplast）是質體的一(yī)種, 是高(gāo)等植物(wù)和一(yī)些藻類所特有的能(néng)量轉換器(qì)，是光(guāng)合作用的反應場所。在高(gāo)等植物(wù)中葉綠體象雙凸或平凸透鏡，長(cháng)徑5~10μm，短徑2~4μm，厚2~3μm。高(gāo)等植物(wù)的葉肉細胞一(yī)般含50～200個(gè)葉綠體，可占細胞質的40%，葉綠體的數目因物(wù)種細胞類型，生(shēng)态環境，生(shēng)理狀态而有所不同。葉綠體由葉綠體被膜(chloroplast envelope)、類囊體(thylakoid)和基質(stroma)三部分組成，含有3種不同的膜：外膜、内膜、類囊體膜和3種彼此分開(kāi)的腔：膜間隙、基質和類囊體腔。類囊體膜上(shàng)含有光(guāng)合色素和電(diàn)子傳遞鏈組分，光(guāng)反應在此上(shàng)進行，因此類囊體膜也稱光(guāng)合膜。

本公司的植物(wù)類囊體膜提取試劑盒采用差速離心方法，可以從(cóng)植物(wù)中提取到(dào)高(gāo)純度的類囊體膜樣品。

1. 即用型試劑盒，用戶不需要單獨配制各種溶液。

2. 每次處理30 g葉片計算(suàn)，本産品可使用8-10次提取，每次能(néng)得到(dào)8-10 mg左右類囊體膜樣品。

3. 已經成功用于拟南(nán)芥，綠蘿，菠菜，豌豆，煙(yān)草(cǎo)等植物(wù)，還(hái)可用于更多(duō)植物(wù)（可能(néng)需要優化條件(jiàn)）。

● 貯存及運輸：

4-8℃保存，至少一(yī)年(nián)有效；試劑盒常溫運輸。

● 産品組成：

● 使用說明：

注意：類囊體膜對溫度高(gāo)度敏感，所以整個(gè)操作必須在冰上(shàng)或者在冷室進行，所用器(qì)皿和

溶液均需要在4℃預冷。離心時一(yī)定要在4℃進行，離心力以g而不是rpm計算(suàn)。如果需要研究類囊體膜的功能(néng)，提取過程還(hái)需要在昏暗(àn)的光(guāng)線條件(jiàn)下(xià)進行。

需要自(zì)備材料：

剪刀；50 ml尖底或圓底離心管；15 ml尖底或圓底離心管；勻漿機(jī)；低(dī)溫離心機(jī)。

1.1 材料預處理：

葉片在實驗前需先用自(zì)來水(shuǐ)洗淨，再用蒸餾水(shuǐ)淋洗，去掉多(duō)餘水(shuǐ)分。如果葉片采集後不能(néng)立即處理，則保存時需要保持葉片濕潤，即使如此，葉片采集後的放(fàng)置時間也不能(néng)超過一(yī)天。

1.2  1×類囊體膜提取緩沖液（即用型）配制：

注：一(yī)個(gè)30克樣品提取反應需要 120 ml 1×類囊體膜提取緩沖液（即用型）。

1.3 葉片勻漿：

1.3.1 新鮮采集植物(wù)葉片（約30克），快速去除葉脈并将葉片剪成1-3 cm²大小(xiǎo)的碎片并浸泡在120 ml的預冷的1×類囊體膜提取緩沖液（即用型）中（每克葉片加4 ml）。

1.3.2 将浸泡了葉片的溶液轉移到(dào)電(diàn)動勻漿機(jī)（即家用制備果汁的勻漿機(jī)，可選貨号：RT-2243A）中，低(dī)速勻漿5秒(miǎo)，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入勻漿機(jī)底部後，再低(dī)速勻漿5秒(miǎo)。注意：除電(diàn)動勻漿機(jī)外，還(hái)可以選擇玻璃勻漿器(qì)和研磨（加玻璃珠）等裂解細胞的方法，但這些方法的單次處理量都比較小(xiǎo)，需要将樣品分成很多(duō)小(xiǎo)份單獨勻漿，然後再彙集。注：不要用液氮研磨，會(huì)損傷類囊體膜；不要過度勻漿，把葉片打碎即可，否則會(huì)降低(dī)類囊體膜得率。

1.3.3過濾勻漿液：2層過濾紙(zhǐ)放(fàng)于漏鬥上(shàng)，用漏鬥将濾液收集到(dào)預冷的250 ml量筒中，一(yī)般分三次收集，總共可收集80-85 ml濾液，将濾液等分到(dào)4個(gè)預冷的50 ml的塑料離心管中（每個(gè)管中的濾液不要超過35 ml）。

1.4類囊體膜收集：

  4℃ 4200 g離心15分鍾，小(xiǎo)心棄上(shàng)清，沉澱即為(wèi)類囊體膜。

1.5 類囊體膜漂洗：

1.5.1 在類囊體膜沉澱中加入1 ml 預冷的類囊體膜漂洗液，手彈離心管底部使沉澱重懸；再補加1 ml預冷的類囊體膜漂洗液，徹底重懸沉澱。

注：重懸時最好避免溶液起泡，手指輕彈，不要用槍頭吹打，否則容易損傷類囊體膜。

1.5.2  4度10000 g離心2分鍾，棄上(shàng)清，保留沉澱。

1.6 類囊體膜重懸：

1.6.1  沉澱中加入1 ml的類囊體膜溶解液，手彈離心管底部使沉澱重懸；再補加1 ml預冷的類囊體膜溶解液，徹底重懸沉澱。

1.6.2  4℃10000 g離心2分鍾，上(shàng)清為(wèi)可溶性蛋白(bái)（根據實驗需要保留），沉澱為(wèi)類囊體膜組分。

1.6.3 沉澱中加入1 ml類囊體膜溶解液，輕柔重懸沉澱，合并4管溶液，即為(wèi)最終得到(dào)的類囊體膜溶液，約4 ml。

1.7 類囊體膜溶液定量：

通(tōng)常類囊體膜蛋白(bái)含量用單位葉綠素含量來表示，即x μg 葉綠素/ml 類囊體膜溶液。

1.7.1 取5 μl 類囊體膜溶液加入到(dào)995 μl 80%丙酮溶液中，混勻。

1.7.2 10000 g 4℃離心2分鍾，吸取上(shàng)清，測定OD₆₆₃和OD₆₄₆ 吸光(guāng)值，用80%丙酮做空白(bái)對照(zhào)。

1.7.3 根據以下(xià)公式計算(suàn)葉綠素：

葉綠素濃度（μg Chl/ml）=200×（17.32×OD₆₄₆+7.18×OD₆₆₃） 注：200為(wèi)稀釋倍數。

1.8 類囊體膜貯存：

将類囊體膜樣品用類囊體膜溶解液稀釋到(dào)濃度為(wèi)1mg Chl/ml，根據需要适量分裝，如50 μl/管，-80℃保存。

1.9 類囊體膜樣品溶解和電(diàn)泳：

類囊體膜增溶緩沖液配制：

将2.5 ml增溶緩沖液（2×）全部加入到(dào)增溶劑粉末中，加入滅菌水(shuǐ)定容至5 ml，徹底混勻，即配成5 ml增溶緩沖液，适量分裝，-20℃貯存，盡量避免反複凍融。

1.9.1 取50 μl(濃度為(wèi)1 mg Chl/ml)類囊體膜樣品, 4℃ 16000 g離心5分鍾，棄上(shàng)清。

1.9.2 沉澱中加入50 μl類囊體膜增溶緩沖液重懸樣品（此時樣品濃度為(wèi)1 mg Chl/ml），輕柔混勻，避免産生(shēng)大量氣泡，冰浴10 min； 4℃ 16000 g離心15 min；上(shàng)清為(wèi)綠色，有微量沉澱。 注：如上(shàng)清為(wèi)無色，說明增溶不好。

1.10

 實驗示例：