動物(wù)膜蛋白(bái)提取試劑盒（細胞樣品）

(Animal Membrane Protein Extraction Kit for Cells)

● 産品簡介

動物(wù)膜蛋白(bái)提取試劑盒（細胞樣品）(Animal Membrane Protein Extraction Kit for Cells)提供了一(yī)種簡便的地從(cóng)培養細胞或貼壁細胞中提取膜蛋白(bái)的方法。提取的膜蛋白(bái)不僅包括質膜上(shàng)的膜蛋白(bái)，也包括細胞器(qì)膜如線粒體膜、内質網膜和高(gāo)爾基體膜上(shàng)的膜蛋白(bái)。

本産品與許多(duō)用于分離膜蛋白(bái)的程序不同，該試劑盒不需要超聲，不需要耗時的超速離心，不使用去垢劑，最大限度地保持了膜蛋白(bái)在細胞内的原始狀态。提取的基本原理是通(tōng)過提取溶液和離心柱的協調作用提取得到(dào)高(gāo)純度的膜蛋白(bái)。膜蛋白(bái)提取溶液可以溫和作用于細胞膜，改變細胞的滲透壓，然後在高(gāo)速離心下(xià)細胞通(tōng)過離心柱，這個(gè)過程中細胞膜會(huì)破裂；收集液700 g低(dī)速離心分離去除細胞核，因此消除了膜組分中細胞核組份的污染；随後上(shàng)清使用常規台式低(dī)溫離心機(jī)（無需超速離心）16000 g高(gāo)速離心，沉澱即為(wèi)膜蛋白(bái)。

該産品約60分鍾即可完成培養細胞膜蛋白(bái)的提取。膜蛋白(bái)是在溫和、非變性條件(jiàn)下(xià)提取的，結合不同的溶解液，溶解後的膜蛋白(bái)可以用于SDS-PAGE變性電(diàn)泳檢測、Blue Native非變性電(diàn)泳檢測以及等電(diàn)聚焦電(diàn)泳等。另外，膜蛋白(bái)也可以用于酶活性測定，免疫沉澱，ELISA測定等。

對于細胞樣品，如果每次使用細胞的數量為(wèi)2-5×10⁶，本試劑盒可以提取125個(gè)樣品；如果每次使用的細胞數量為(wèi)1×10⁷細胞，本試劑盒可以提取50個(gè)樣品。

● 産品組成

● 貯存、效期和運輸：

根據标簽溫度貯存；一(yī)年(nián)有效；試劑盒常溫運輸。

● 用前必讀(dú)：

1. 離心機(jī)請調整成RCF/g模式，按照(zhào)離心力設置離心機(jī)（不要根據轉速rpm模式設置），所有離心步驟都需要在4℃低(dī)溫離心機(jī)中進行。

2. 将膜蛋白(bái)提取溶液混勻後放(fàng)置于冰上(shàng)。将離心柱套入2 ml連蓋收集管中，蓋好管蓋，放(fàng)置于冰上(shàng)預冷。

3. 蛋白(bái)提取推薦添加蛋白(bái)酶抑制劑（自(zì)備，試劑盒不提供），根據蛋白(bái)酶抑制劑母液濃度提前添加在膜蛋白(bái)提取溶液中（如抑制劑母液是 100×，添加時按照(zhào)1:100添加，即1ml膜蛋白(bái)提取溶液添加10μl抑制劑）。研究蛋白(bái)磷酸化，需要添加磷酸酶抑制劑（自(zì)備，試劑盒不提供）。

4. 蛋白(bái)定量推薦使用BCA方法，可以選擇BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒（貨号：RTP7102）。

● 使用方法：

一(yī) 培養細胞膜蛋白(bái)提取：

1.1 準備溶液：

混勻膜蛋白(bái)提取溶液，立即放(fàng)置在冰上(shàng)。取适當量的溶液，在使用前數分鍾内加入蛋白(bái)酶抑制劑（自(zì)備，試劑盒不提供），随後立即放(fàng)于冰上(shàng)待用。按照(zhào)下(xià)表大體估算(suàn)膜蛋白(bái)提取溶液使用體積：

注： (二百萬，2×10⁶)HeLa細胞，其細胞沉澱體積（PCM，Packed Cell Volume）大約為(wèi)20 μl。

1.2 準備細胞：

1.2.1 對于貼壁細胞：細胞用PBS漂洗一(yī)遍，棄PBS；再加入适量PBS，用細胞刮刀刮下(xià)細胞，或用0.02% EDTA（0.5 mM）溶液處理細胞使細胞不再貼壁很緊，并用移液器(qì)吹打下(xià)細胞。400 g（~2000 rpm） 4℃離心5 min收集細胞，盡最大努力吸盡上(shàng)清，留下(xià)細胞沉澱備用。盡量避免用胰酶消化細胞，以免胰酶降解需提取的目的蛋白(bái)。

1.2.2 對于懸浮細胞：400 g（~2000 rpm）4℃離心5 min收集細胞，用PBS洗一(yī)遍，離心收集細胞，盡最大努力吸盡上(shàng)清，留下(xià)細胞沉澱備用。

1.3 裂解細胞膜：

1.3.1細胞沉澱中加入準備好的膜蛋白(bái)提取溶液（含蛋白(bái)酶抑制劑），用移液器(qì)吹打重懸細胞沉澱，渦旋劇烈震蕩30-60秒(miǎo)，冰浴處理10分鍾，間歇2-3混勻。

注：提取溶液使用推薦經驗值：起始細胞數低(dī)于5×10⁶加入 200 μl 提取溶液，起始細胞數量5×10⁶-1×10⁷加入500 μl提取溶液。如果細胞數目低(dī)于1×10⁶或高(gāo)于1×10⁷，建議調整細胞數目在2-5×10⁶範圍内。

1.3.2 将細胞懸液轉移到(dào)離心柱中，蓋上(shàng)管蓋，16,000 g（~13000 rpm） 4℃離心1分鍾，離心後收集管底部會(huì)有沉澱形成。

     注：離心柱最大體積為(wèi)600 μl；确保離心機(jī)可以在10秒(miǎo)内達到(dào)16000 g。

   1.3.3 棄去離心柱，蓋好2 ml收集管管蓋，用1ml移液器(qì)輕柔吹打重懸收集管中的沉澱。

1.4 去除細胞核：

溶液700 g（~2700 rpm） 4℃離心1分鍾，用200 μl吸頭小(xiǎo)心将上(shàng)清（上(shàng)清稍有渾濁）轉移到(dào)新的1.5 ml離心管中。注意：轉速不要超過700g，否則會(huì)降低(dī)膜蛋白(bái)的得率。

     關鍵步驟：吸取上(shàng)清時不要觸及沉澱，甚至可以丢棄部分上(shàng)清不吸取，以免上(shàng)清（含膜蛋白(bái)）中污染核蛋白(bái)。如果使用200 μl提取溶液，建議吸取150 μl上(shàng)清；使用500 μl提取溶液，建議吸取400 μl上(shàng)清。此步驟得到(dào)的細胞核純度不高(gāo)，混雜(zá)有沒有完全破碎的完整細胞，不建議用于相(xiàng)關實驗。

1.5 沉澱膜蛋白(bái)：

上(shàng)清溶液16000 g（~13000 rpm） 4℃離心30分鍾，用200 μl吸頭吸棄上(shàng)清，沉澱即為(wèi)提取的膜蛋白(bái)。上(shàng)清是胞漿蛋白(bái)，如需要可保存備用。

關鍵步驟：此步驟必須完全将上(shàng)清吸取幹淨，可以分次吸取上(shàng)清，最後用10 μl吸頭将殘餘上(shàng)清徹底吸淨，以免膜蛋白(bái)中污染胞漿蛋白(bái)。

 二 膜蛋白(bái)溶解：

膜蛋白(bái)沉澱可以根據下(xià)遊實驗需求用50 μl相(xiàng)應溶解液溶解。

注：不建議加入超過50 μl溶解液，會(huì)導緻蛋白(bái)濃度偏低(dī)。

2.1 膜蛋白(bái)變性樣品處理：

2.1.1 建議使用50 μl變性蛋白(bái)溶解液（貨号：PS1020）溶解膜蛋白(bái)；

2.1.2 BCA方法測定蛋白(bái)濃度；

2.1.3用變性蛋白(bái)溶解液調整蛋白(bái)濃度為(wèi)1 μg/μl，按需分裝，每管50 μl，-80℃保存待用；

2.1.4取一(yī)管50 μl樣品加入SDS-PAGE上(shàng)樣緩沖液（貨号：PL080，PL113，PL121）處理，建議調整上(shàng)樣液濃度為(wèi)0.5 μg/μl；對于多(duō)次跨膜蛋白(bái)（Multi-pass membrane protein）的變性電(diàn)泳檢測，樣品建議使用37℃處理30分鍾或者70度處理10分鍾，不要95℃加熱5分鍾，因為(wèi)在95℃高(gāo)溫情況下(xià)，多(duō)次跨膜蛋白(bái)極易聚集形成多(duō)聚體，樣品會(huì)聚集，WB檢測會(huì)表現為(wèi)比實際蛋白(bái)大小(xiǎo)更大的分子量；

2.1.5 使用SDS-PAGE凝膠（貨号：RTD6132，RTD6116）電(diàn)泳，每個(gè)泳道上(shàng)樣10-40 μl（5-20 μg）。

2.2 膜蛋白(bái)BN非變性樣品處理：

2.2.1 建議使用50 μl膜蛋白(bái)重懸液（BN電(diàn)泳用）（貨号：PN1020）重懸膜蛋白(bái)沉澱；

2.2.2 BCA方法測定蛋白(bái)濃度（貨号：RTP7102）；

2.2.3 用膜蛋白(bái)重懸液（BN電(diàn)泳用）調整蛋白(bái)濃度為(wèi)1 μg/μl，按需分裝，每管50 μl，-80℃保存待用；

2.2.4 取一(yī)管50 μl樣品，溶化混勻後4℃ 16000 g 5分鍾，去除上(shàng)清，保留沉澱；

2.2.5 沉澱中加入50 μl膜蛋白(bái)增溶液A（貨号：DM1080），輕柔重懸沉澱，盡量不産生(shēng)氣泡，冰浴10分鍾；

膜蛋白(bái)增溶液A配制方法：在增溶劑粉末管中加入2.5 ml溶解緩沖液，加入超純水(shuǐ)精準定容至5 ml，徹底混勻，增溶液中DDM終濃度為(wèi)1%。

2.2.6 4℃ 16000 g 15分鍾，取上(shàng)清至一(yī)幹淨1.5 ml離心管中即為(wèi)增溶後膜蛋白(bái)溶液（小(xiǎo)心不要吸取沉澱），此時得到(dào)的膜蛋白(bái)濃度為(wèi)1 μg/μl，其中去垢劑DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）終濃度為(wèi)1%；

2.2.7 膜蛋白(bái)溶液中加入1/10體積10×膜蛋白(bái)A型上(shàng)樣緩沖液（配套膜蛋白(bái)增溶液A使用）（貨号：PL130），使用BN凝膠電(diàn)泳（貨号：RTD6139，RTD6140），每個(gè)泳道上(shàng)樣5-20 μg。

2.3 膜蛋白(bái)等電(diàn)聚焦樣品處理（2D凝膠第一(yī)維電(diàn)泳）：

建議膜蛋白(bái)沉澱中使用溶解液：7 M尿素,2 M硫脲, 2%CHAPS,20mM DTT(自(zì)備，試劑盒不提供)。

 三 關于膜蛋白(bái)産量和質量的評價：

 3.1 膜蛋白(bái)産量：

3.2 膜蛋白(bái)質量評價：

膜蛋白(bái)質量評價首先看(kàn)提取的蛋白(bái)是否是膜蛋白(bái)，其次要看(kàn)膜蛋白(bái)是否有明顯的富集，其三要看(kàn)提出的膜蛋白(bái)是否有其他組分交叉污染，最後看(kàn)提取的膜蛋白(bái)中是否可以檢測出目的蛋白(bái)。使用專門(mén)的膜内參檢測（下(xià)表），可以初步确認提出的是膜蛋白(bái)。膜蛋白(bái)是否有效富集需要用總蛋白(bái)作為(wèi)對照(zhào)，與總蛋白(bái)相(xiàng)比，膜蛋白(bái)中膜蛋白(bái)内參是否有明顯富集。膜蛋白(bái)中的交叉污染可以用其他組分内參檢測膜蛋白(bái)樣品，如關注膜蛋白(bái)中是否有細胞核蛋白(bái)污染，可以使用核蛋白(bái)内參如Lamin B1檢測膜蛋白(bái)，檢測無條帶即說明膜蛋白(bái)與細胞核組分無交叉污染。用目标蛋白(bái)抗體檢測膜蛋白(bái)，驗證是否可以檢測到(dào)目的蛋白(bái)，蛋白(bái)大小(xiǎo)是否符合預期。

許多(duō)研究人員(yuán)利用 WB對分離的膜蛋白(bái)進行純度檢測，經常發現一(yī)些常用的胞漿内參能(néng)在膜蛋白(bái)中檢測到(dào)，例如β-actin^[1], GAPDH ^[2] 和  β-tubulin ^[3]，這是由于這些胞漿内參不僅存在于胞漿也存在于質膜中，因此可以在膜蛋白(bái)中檢測到(dào)胞漿内參。更多(duō)信息，請參閱以下(xià)論文：

1. Gruenstein E., et al. (1975). Actin associated with membranes from 3T3 mouse fibroblast and Hela cells. Journal of cell Biology. 64:223-234.  

2. Terrasse R., et al. (2012). Human and pneumococcal cell surface glyceraldehydes  -3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) proteins are both ligands of human C1q protein. J. Biol. Chem. 287:42620-42633.

3. Wolff J. (2009). Plasma membrane tubulin. Biochemica et BiophysicaActa. (BBA)-Biomembranes 1788:1415-1433.

四 實驗示例：

樣品：K562細胞，膜蛋白(bái)提取試劑盒提取膜蛋白(bái)（M）和胞漿蛋白(bái)（C），RIPA提取總蛋白(bái)（TP）

溫度處理：樣品與SDS-PAGE蛋白(bái)上(shàng)樣緩沖液（貨号：PL080）混合，37度處理30min，70度處理10min，95度處理5min

電(diàn)泳：4-18% RealPAGE預制膠（貨号：RTD6119-0420），蛋白(bái)上(shàng)樣量均為(wèi)5 μg，恒壓200V  55min

轉膜：0.45μm PVDF膜，1×RealBlot轉膜緩沖液（貨号：RT5020）濕轉，恒流400 mA 35min。

封閉：快速封閉液（貨号：WR5020）  RT  10 min

剝離：Western一(yī)抗二抗去除液（弱堿，溫和型） （貨号：WS1200），37度搖床15 min

一(yī)抗：1 Na-K ATPase  1:5000；2 Calnexin 1:500；3 β-Tubulin 1:5000 ；4 β-Actin 1:10000；5 GAPDH 1:10000； 6 H3 1:10000；7 COXIV 1:5000；常溫搖床孵育60min

二抗：羊抗兔IgG-HRP 1:5000（貨号：HGR1020），羊抗鼠IgG-HRP 1:5000（貨号：HGM1060），常溫搖床孵育60min

檢測：ECL發光(guāng)檢測（貨号：EC2520）