高(gāo)分子量蛋白(bái)（大于150 kD）Western Blot攻略

高(gāo)分子量蛋白(bái)（大于150 kD）Western Blot攻略

注：該文引自(zì)基因幫公衆号天才試劑君文章，略有修改。  Ver.730875

● 一(yī) 選對凝膠很重要

三種最常見(jiàn)的凝膠系統包括Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate系統。

Tris-Glycine凝膠的pH為(wèi)8.6，且保質期很短，一(yī)般4-8℃保存有效期一(yī)個(gè)月(yuè)。在跑膠的過程中，凝膠系統的pH還(hái)有上(shàng)升的趨勢，可達到(dào)9.5，這會(huì)導緻蛋白(bái)降解和低(dī)分辨率。

Bis-Tris凝膠的pH為(wèi)~6.5，相(xiàng)對Tris-Glycine凝膠，穩定性和保質期都有所增加，4-8℃貯存可以保存一(yī)年(nián)。但這種凝膠更适合于低(dī)分子量電(diàn)泳分離（低(dī)于200 kD），不适合高(gāo)分子量蛋白(bái)電(diàn)泳。

Tris-Acetate 凝膠的pH為(wèi)~7，跑大分子蛋白(bái)會(huì)呈現很高(gāo)的分辨率，同時4-8℃貯存可以保存一(yī)年(nián)。

所以跑大分子蛋白(bái)時，我們推薦使用Tris-Acetate 凝膠（貨号：RTD6162；RTD6155）。

● 二 凝膠濃度很重要

既然選擇了Tris-Acetate 凝膠，要考慮凝膠濃度的問題。凝膠濃度與孔徑成反比：濃度越小(xiǎo)，孔越大，較大的蛋白(bái)質更容易通(tōng)過較大的孔，所以建議使用低(dī)百分比的Tris醋酸凝膠（貨号：RTD6162），如6％等度膠。也可以使用梯度凝膠，但是制作梯度凝膠會(huì)恨棘手，需要一(yī)個(gè)梯度凝膠生(shēng)成系統（貨号：RT-GZY02），不過現在很多(duō)公司都會(huì)出售具有不同範圍的梯度預制膠（貨号：RTD6155），節省時間。

● 三 電(diàn)泳内槽緩沖液需要添加抗氧化劑

Tris-醋酸電(diàn)泳使用10×Tris-醋酸-SDS電(diàn)泳緩沖液（貨号：TA050），經典的Tris-甘氨酸-SDS電(diàn)泳緩沖液無法兼容使用。由于DTT在pH中性時，基本不随著(zhe)樣品泳動，為(wèi)保證蛋白(bái)樣品在電(diàn)泳中維持還(hái)原力，Tris-Acetate 凝膠電(diàn)泳時，電(diàn)泳槽内槽緩沖液需要添加抗氧化劑（貨号：TA1510），這樣可以保證整個(gè)電(diàn)泳過程中蛋白(bái)的變性還(hái)原狀态，提高(gāo)樣品的分辨率。

● 四 提高(gāo)轉膜緩沖液中的SDS，減少甲醇

高(gāo)分子量蛋白(bái)轉膜緩沖液中的組成至關重要。如果有甲醇存在，大分子蛋白(bái)很容易沉澱，可以通(tōng)過減少轉膜緩沖液中的甲醇百分比（10％或更低(dī)）來避免這種情況發生(shēng)。為(wèi)了進一(yī)步确保蛋白(bái)質不會(huì)沉澱，考慮在轉膜緩沖液中添加SDS至終濃度為(wèi)0.05%-0.1％。SDS向蛋白(bái)添加均勻的負電(diàn)荷，使得它們更容易從(cóng)凝膠轉移到(dào)膜上(shàng)。高(gāo)分子量蛋白(bái)的轉膜緩沖液可以選擇10×Tris-醋酸轉膜緩沖液（濕轉，粉末型）（貨号：TA5030P）

● 五 選擇合适的轉印膜

轉印膜一(yī)般有PVDF膜或NC膜，跑大分子蛋白(bái)建議選擇PVDF膜。如前面所說，如果有甲醇存在，大分子蛋白(bái)很容易沉澱。而PVDF膜可以不需要在轉膜緩沖液中添加甲醇，目的蛋白(bái)轉印的機(jī)會(huì)更高(gāo)。PVDF膜有各種孔徑尺寸，最常見(jiàn)的是0.22 μm和0.45 μm。與凝膠一(yī)樣，較大的蛋白(bái)比較小(xiǎo)的蛋白(bái)更容易穿過大孔隙。高(gāo)分子量蛋白(bái)質可以用0.45μm膜（貨号：ML-PV-131545-5）轉移，避免使用0.22 μm孔徑。

● 六 增加轉印時間

在正确的選擇完凝膠、轉印膜及轉移緩沖液後，轉印正式開(kāi)始。半幹轉快且方便，但不适用于大分子蛋白(bái)。大分子蛋白(bái)建議濕轉，因為(wèi)大分子蛋白(bái)轉移時間很慢(màn)，推薦350-400 mA轉移90 min或 4℃，40 mA，轉印過夜。

● 七 關于轉印膜封閉

沒有任何一(yī)種封閉試劑能(néng)通(tōng)用于蛋白(bái)封閉。BSA通(tōng)常作為(wèi)NC膜的封閉液，但是對于PVDF膜，它的封閉效果并不是最好。大蛋白(bái)轉膜後的封閉可以選擇5%脫脂奶粉（貨号：WN1070）。

另外，不要讓PVDF膜在檢測過程中的任何時間點幹透，如果膜部分變幹，可以讓膜完全幹掉，然後用甲醇重新潤濕，之後用緩沖液浸泡，繼續操作。