6%Tris-醋酸-SDS-PAGE電(diàn)泳試劑盒（變性電(diàn)泳，手灌膠）

● 産品組成：

● 産品簡介：

Tris-醋酸-SDS-PAGE凝膠電(diàn)泳适合于分離高(gāo)分子量蛋白(bái)，可以有效分離50-500 kD範圍内蛋白(bái)；電(diàn)泳體系呈中性，能(néng)有效提高(gāo)蛋白(bái)的穩定性；電(diàn)泳緩沖體系中加入抗氧化劑，整個(gè)電(diàn)泳過程都在還(hái)原條件(jiàn)下(xià)進行，有效防止二硫鍵的形成。

該試劑盒包含凝膠制備、蛋白(bái)上(shàng)樣、蛋白(bái)電(diàn)泳、蛋白(bái)染色及轉膜所需的全部試劑。試劑盒配套的制膠溶液，可以配制10闆厚度1mm凝膠（面積8×10 cm），分離膠濃度為(wèi)6%，可以有效分離50-500 kD範圍内蛋白(bái)。配好的凝膠濃縮膠為(wèi)紅(hóng)色，方便上(shàng)樣。本試劑盒用于蛋白(bái)變性還(hái)原電(diàn)泳，不适用于蛋白(bái)非變性電(diàn)泳。

按照(zhào)一(yī)次實驗電(diàn)泳一(yī)闆凝膠計算(suàn)，本試劑盒可以使用10次。

● 貯存、運輸及效期：

   按照(zhào)标簽溫度貯存；試劑盒常溫運輸；有效期一(yī)年(nián)。

● 使用說明：

一(yī). 實驗準備：

1.1 改良型促凝劑為(wèi)幹粉，用前加入8 ml超純水(shuǐ)震蕩徹底溶解，适量分裝後取一(yī)管使用。溶解後的促凝劑-20℃貯存。

1.2 400×抗氧化劑為(wèi)幹粉，用前加入15 ml超純水(shuǐ)震蕩徹底溶解後使用，已經溶解的400×抗氧化劑-20℃貯存。

二. 凝膠配制：

2.1參照(zhào)凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。

2.2 根據下(xià)表配制凝膠：

2.2.1 取等體積下(xià)層膠溶液B 和下(xià)層膠溶液A ，各 2.0/2.5/4.0 ml，混勻；

2.2.2混合溶液中加入 40/50/80 μl的改良型促凝劑，輕輕混勻，将混勻後的溶液注入制膠玻璃闆中，使液面和短玻璃闆上(shàng)沿之間的距離比梳齒長(cháng)0.5 cm即可；

注意：此溶液為(wèi)過量，請勿全部注入。

2.2.3 沿玻璃闆緩慢(màn)加入适量滅菌水(shuǐ)或無水(shuǐ)乙醇覆蓋于下(xià)層膠之上(shàng)，待下(xià)層膠凝固後，倒去上(shàng)層水(shuǐ)或乙醇；

注意：當水(shuǐ)（乙醇）和膠之間有一(yī)條折射線時，說明膠已凝固；25℃時5-10分鍾可以聚合。

2.2.4 取等體積彩色上(shàng)層膠溶液B和上(shàng)層膠溶液A ，各 0.5/0.75/1.0 ml，混勻；

2.2.5向混合溶液中加入 10/15/20 μl 的改良型促凝劑，輕輕混勻，插入梳齒；

2.2.6 待上(shàng)層膠凝固後 （約20-40 min），拔去梳齒即可用于電(diàn)泳。

注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高(gāo)時，聚合較快；冬天氣溫低(dī)時，聚合時間會(huì)延長(cháng)。

上(shàng)層膠25℃ 20-25分鍾可以聚合；18℃ 35-40分鍾可以聚合。

三. 電(diàn)泳：

3.1 準備1×電(diàn)泳緩沖液：

3.1.1 外槽緩沖液：取适量體積1×電(diàn)泳緩沖液用于外槽緩沖液。

3.1.2 内槽緩沖液：200 ml 1×電(diàn)泳緩沖液中加0.5 ml 400×抗氧化劑，混合均勻後用于内槽緩沖液。

3.2準備上(shàng)樣樣品：

注：表格以配制10 μl樣品為(wèi)例，其他體積按照(zhào)比例調整。

3.3電(diàn)泳過程；

在電(diàn)泳槽的内槽加入内槽緩沖液（已加入抗氧化劑），讓電(diàn)泳緩沖液漫過加樣孔，輕輕的撥出梳子，用1ml吸頭沖洗加樣孔3次；随後在電(diàn)泳槽外槽加入适量的外槽緩沖液（不用添加抗氧化劑）。上(shàng)樣，電(diàn)泳。

四. 染色：

注：如果隻是觀察蛋白(bái)的分離情況，對凝膠進行染色。如果要後續進行WB實驗，凝膠不要染色，進行步驟五。

4.1 将電(diàn)泳後的PAGE膠取下(xià)放(fàng)入塑料容器(qì)中，加入适量FastBlue蛋白(bái)染色液（以剛剛覆蓋過膠面為(wèi)适），搖床常溫搖動，條帶5-10分鍾即可見(jiàn)（蛋白(bái)含量高(gāo)于1 μg條帶）。

4.2 搖床常溫繼續搖動15-30分鍾至條帶清晰可見(jiàn)。

4.3 加入适量蒸餾水(shuǐ)脫色，期間更換1-2次蒸餾水(shuǐ)，搖床常溫搖動10-15分鍾至背景幹淨。

4.4 觀察保存結果。

五. 轉膜：

5.1 轉印膜選擇：

Tris-醋酸凝膠轉膜可以使用NC膜和PVDF膜，需要選擇0.45 μm孔徑。PVDF膜使用前注意需要用甲醇潤濕活化。

5.2 10×Tris-醋酸轉膜緩沖液（溶液型）配制：

将10×Tris-醋酸轉膜緩沖液（濕轉，粉末型）粉末溶解于500 ml超純水(shuǐ)中，即配成500 ml 10×Tris-醋酸轉膜緩沖液（溶液型），不要調節pH，pH~7.2。

5.3 準備1×轉膜緩沖液：

注：甲醇和SDS在轉膜中有拮抗作用。甲醇使蛋白(bái)更加結合在膜上(shàng)，而SDS讓蛋白(bái)更加離開(kāi)膜。因此對大蛋白(bái)轉膜來說，多(duō)加SDS，少加甲醇；而對小(xiǎo)蛋白(bái)轉膜，多(duō)加甲醇，少加SDS。

5.4 轉膜條件(jiàn)：

高(gāo)分子量蛋白(bái)建議濕轉。以下(xià)轉膜條件(jiàn)僅供參考，客戶針對自(zì)己的目的蛋白(bái)，最好經過1-2次預實驗後，确定最佳的轉膜條件(jiàn)。

六. 實驗示例：

凝膠：6%Tris醋酸手灌膠
電(diàn)泳：1×TAS 200V 70-42mA 55min；内槽加抗氧化劑
染色：FastBlue蛋白(bái)染色液染色 15 分鍾
樣品：4K-BME-細菌裂解物(wù)；K562-懸浮細胞RIPA提取總蛋白(bái)