RealPAGE plus彩色凝膠快速制備試劑盒
RealPAGE plus Colour Gel Fast Preparation Kit
● 貨品規格：
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貨号
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說明
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制膠數量
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RTD6132-06
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制備6%PAGE膠
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125塊 0.75mm膠
＞90塊1 mm膠
＞60塊1.5 mm膠
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RTD6132-08
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制備8%PAGE膠
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RTD6132-10
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制備10%PAGE膠
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RTD6132-12
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制備12%PAGE膠
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RTD6132-15
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制備15%PAGE膠
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● 貨品内容：
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組份
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貨号
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名稱
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規格
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保存
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1
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RTD6132-UA
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上(shàng)層膠溶液A
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80 ml
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4℃
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2
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RTD6132-UB
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彩色上(shàng)層膠溶液B
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80 ml
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4℃
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3
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RTD6132-LA06
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下(xià)層膠溶液A 6%
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250 ml
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4℃
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RTD6132-LA08
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下(xià)層膠溶液A 8%
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250 ml
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4℃
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RTD6132-LA10
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下(xià)層膠溶液A 10%
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250 ml
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4℃
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RTD6132-LA12
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下(xià)層膠溶液A 12%
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250 ml
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4℃
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RTD6132-LA15
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下(xià)層膠溶液A 15%
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250 ml
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4℃
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4
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RTD6132-LB
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下(xià)層膠溶液B
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250 ml
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4℃
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5
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RTD6132-SP
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改良型促凝劑
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8 ml
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4℃，配制後-20℃貯存
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說明書
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一(yī)份
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● 産品簡介：
該産品利用聚丙烯酰胺凝膠電(diàn)泳原理，采用合理設計的預混合配方和配制流程，可在50分鍾内配制得到(dào)高(gāo)質量的聚丙烯酰胺凝膠，用于變性和非變性蛋白(bái)凝膠電(diàn)泳。本産品可以配制常用分離膠濃度6%、8%、10%、12%和15%，可以滿足絕大多(duō)數蛋白(bái)電(diàn)泳需求。
本試劑盒大約可以配制60-125塊常規大小(xiǎo)（8×10cm）PAGE凝膠，具體數量根據凝膠厚度決定：0.75mm厚度凝膠可以配制125塊膠，1mm厚度凝膠可以配制至少90塊膠，1.5mm厚度凝膠可以配制至少60塊膠。
● 運輸和貯存：
本産品常溫運輸；組份按照(zhào)标簽溫度貯存；有效期一(yī)年(nián)。
● 特點：
1. 方便：彩色上(shàng)層膠，方便上(shàng)樣；上(shàng)層膠和下(xià)層膠溶液1:1混合，無需計算(suàn)；
2. 安全：不用接觸有毒粉末；不用單獨添加TEMED；
3. 兼容性廣：制膠溶液中不含SDS，可用于非變性電(diàn)泳（Native-PAGE）；
● 使用說明：
一(yī) 凝膠制備：
1.1參照(zhào)凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。
1.2 根據下(xià)表參考選擇合适的凝膠濃度
表一(yī)不同濃度的PAGE下(xià)層膠的最佳分離範圍
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下(xià)層膠（分離膠）濃度
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最佳分離範圍
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6%
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50-350 kD
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8%
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35-300 kD
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10%
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20-150 kD
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12%
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15-100 kD
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15%
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10-80 kD
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1.3 根據下(xià)表配制凝膠：
表二 凝膠配制表
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下(xià)層膠配方
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上(shàng)層膠配方
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膠厚度
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下(xià)層膠溶液B
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下(xià)層膠溶液A
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改良型促凝劑
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膠厚度
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彩色上(shàng)層膠溶液B
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上(shàng)層膠溶液A
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改良型促凝劑
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0.75 mm
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2 ml
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2 ml
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40 μl
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0.75 mm
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0.5 ml
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0.5 ml
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10 μl
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1.0 mm
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2.5 ml
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2.5 ml
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50 μl
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1.0 mm
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0.75 ml
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0.75 ml
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15 μl
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1.5 mm
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4 ml
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4 ml
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80 μl
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1.5 mm
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1 ml
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1 ml
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20 μl
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1.3.1 取等體積下(xià)層膠溶液B 和下(xià)層膠溶液A ，各 2.0/2.5/4.0 ml，混勻；
1.3.2混合溶液中加入 40/50/80 μl的改良型促凝劑，輕輕混勻，将混勻後的溶液注入制膠玻璃闆中，使液面和短玻璃闆上(shàng)沿之間的距離比梳齒長(cháng)0.5 cm即可；
注意：此溶液為(wèi)過量，請勿全部注入。
1.3.3 沿玻璃闆緩慢(màn)加入适量滅菌水(shuǐ)或無水(shuǐ)乙醇覆蓋于下(xià)層膠之上(shàng)，待下(xià)層膠凝固後，倒去上(shàng)層水(shuǐ)或乙醇；
注意：當水(shuǐ)（乙醇）和膠之間有一(yī)條折射線時，說明膠已凝固；25℃時5-10分鍾可以聚合。
1.3.4 取等體積彩色上(shàng)層膠溶液B和上(shàng)層膠溶液A ，各 0.5/0.75/1.0 ml，混勻；
1.3.5向混合溶液中加入 10/15/20 μl 的改良型促凝劑，輕輕混勻，插入梳齒；
1.3.6 待上(shàng)層膠凝固後 （約20-40 min），拔去梳齒即可用于電(diàn)泳。
注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高(gāo)時，聚合較快；冬天氣溫低(dī)時，聚合時間會(huì)延長(cháng)。
上(shàng)層膠25℃ 20-25分鍾可以聚合；18℃ 35-40分鍾可以聚合。
二 電(diàn)泳：
2.1 SDS-PAGE變性電(diàn)泳：
2.1.1電(diàn)泳緩沖液配制：
将5×Tris-甘氨酸-SDS電(diàn)泳緩沖液幹粉（自(zì)備，組份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris，0.5% SDS）全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水(shuǐ)徹底溶解，用水(shuǐ)定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸電(diàn)泳緩沖液（此溶液不用調節pH值）。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電(diàn)泳緩沖液。
2.1.2 樣品處理：融化-混合-變性-上(shàng)樣
5×MonoColor蛋白(bái)上(shàng)樣緩沖液常溫數分鍾解凍後輕輕搖勻，以确保溶液混合均勻；将緩沖液與蛋白(bái)樣品按照(zhào)1：4的比例混勻，如8 μl樣品加入2 μl 5×上(shàng)樣緩沖液；将蛋白(bái)樣品置于95℃中加熱5-10分鍾；蛋白(bái)樣品加入凝膠加樣孔内電(diàn)泳。
2.1.3 電(diàn)泳過程；
在電(diàn)泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸-SDS電(diàn)泳緩沖液(讓電(diàn)泳緩沖液漫過加樣孔)，輕輕的撥出梳子，用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔，随後在電(diàn)泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸-SDS電(diàn)泳緩沖液。
表三 SDS-PAGE電(diàn)泳條件(jiàn)
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恒電(diàn)壓
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起始電(diàn)流（一(yī)闆膠）
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結束電(diàn)流（一(yī)闆膠）
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電(diàn)泳時間
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适用條件(jiàn)
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150V
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35-40 mA
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15-20 mA
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55 + min
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最佳電(diàn)壓，最優的分辨率
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200V
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45-55 mA
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20-25 mA
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45+ min
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節省時間
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225V
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40-50 mA
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15-20 mA
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35+ min
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250V
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65-75 mA
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20-25 mA
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30+ min
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300V
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70-80 mA
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25-35mA
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25+ min
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最省時間
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2.2 非變性電(diàn)泳（Native PAGE）：
2.2.1電(diàn)泳緩沖液配制：
将5×Tris-甘氨酸電(diàn)泳緩沖液幹粉（自(zì)備，組份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris）全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水(shuǐ)徹底溶解，用水(shuǐ)定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸電(diàn)泳緩沖液（此溶液不用調節pH值）。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電(diàn)泳緩沖液。
2.2.2 樣品處理：融化-混合-上(shàng)樣
5×非變性非還(hái)原蛋白(bái)上(shàng)樣緩沖液常溫數分鍾解凍後輕輕搖勻，以确保溶液混合均勻；将緩沖液與蛋白(bái)樣品按照(zhào)1：4的比例混勻，如8 μl樣品加入2 μl 5×上(shàng)樣緩沖液；蛋白(bái)樣品加入凝膠加樣孔内電(diàn)泳。注：非變性電(diàn)泳樣品不能(néng)加熱處理。
2.2.3 電(diàn)泳過程；
在電(diàn)泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸電(diàn)泳緩沖液(讓電(diàn)泳緩沖液漫過加樣孔)，輕輕的撥出梳子，用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔，随後在電(diàn)泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸電(diàn)泳緩沖液。
表四 Native PAGE電(diàn)泳條件(jiàn)
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恒電(diàn)壓
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起始電(diàn)流
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結束電(diàn)流
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電(diàn)泳時間
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适用條件(jiàn)
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推薦電(diàn)壓
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150V
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25-35/闆膠
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5-10 mA/闆膠
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60 + min
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最佳電(diàn)壓，最優的分辨率
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三. 染色：
1. 将電(diàn)泳後的PAGE膠取下(xià)放(fàng)入塑料容器(qì)中，加入适量FastBlue蛋白(bái)染色液或常規考馬斯亮藍染色液（以剛剛覆蓋過膠面為(wèi)适），條帶1-2分鍾即可見(jiàn)。
2. 搖床常溫搖動10-15分鍾至條帶清晰可見(jiàn)。
3. 加入适量蒸餾水(shuǐ)脫色，期間更換1-2次蒸餾水(shuǐ)，搖床常溫搖動10-15分鍾至背景幹淨。
4. 觀察保存結果。
四. 實驗示例：
