Blue Native PAGE凝膠電(diàn)泳常見(jiàn)問題

Blue Native PAGE凝膠電(diàn)泳常見(jiàn)問題

1. 在非變性條件(jiàn)下(xià)，使用Blue Native PAGE凝膠進行非變性電(diàn)泳比使用Tris-甘氨酸凝膠具有哪些優勢？

需要使用非離子洗滌劑進行增溶的樣品不能(néng)兼容傳統的非變性Tris-甘氨酸PAGE，因為(wèi)随著(zhe)蛋白(bái)質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移，會(huì)将非離子洗滌劑遺留在條帶上(shàng)方。當缺少非離子洗滌劑時，蛋白(bái)質會(huì)聚集并在泳道頂部形成垂直線條。當使用藍色非變性電(diàn)泳（Blue Native PAGE凝膠）時，Coomassie G-250可顯著減少蛋白(bái)質的聚集，有效分離膜上(shàng)的蛋白(bái)質複合物(wù)，達到(dào)Tris-甘氨酸凝膠上(shàng)得不到(dào)的效果。此外，與Tris-甘氨酸系統的工(gōng)作pH（pH 9.3–9.5）相(xiàng)比，Blue Native PAGE凝膠較低(dī)的工(gōng)作pH（pH 7.5–7.7）有助于維持堿性pH敏感型蛋白(bái)質的非變性結構和/或活性。

2. Blue Native PAGE凝膠應如何保存？

我們推薦将其保存在4-8℃。不可冷凍。

3. Blue Native PAGE凝膠的蛋白(bái)分離範圍是多(duō)少？

3-12%RealPAGE Native BN/CN 預制膠可分離分子量在45–10,000 kD範圍内的蛋白(bái)質。

4-16%RealPAGE Native BN/CN 預制膠可分離分子量在25–10,000 kD範圍内的蛋白(bái)質。

4. Blue Native PAGE凝膠的推薦樣品上(shàng)樣體積和蛋白(bái)質上(shàng)樣量是多(duō)少？

我們提供的預制膠是12孔，每個(gè)孔的最大上(shàng)樣體積為(wèi)30 μl，推薦每個(gè)泳道的蛋白(bái)含量範圍在20-50 μg。

5. 我的Blue Native PAGE凝膠在電(diàn)泳過程中停止電(diàn)泳了,為(wèi)什麽？該如何繼續電(diàn)泳？

在Blue Native PAGE凝膠電(diàn)泳期間，電(diàn)流下(xià)降至低(dī)于1 mA很常見(jiàn)。有些電(diàn)泳電(diàn)源如伯樂電(diàn)源有負載檢查功能(néng)，電(diàn)流過低(dī)（低(dī)于4mA） 會(huì)認為(wèi)沒有負載，報(bào)錯(cuò)E1錯(cuò)誤代碼，終止電(diàn)泳。解決方法是更換電(diàn)泳電(diàn)源，如使用國(guó)産電(diàn)源；另外可以調高(gāo)電(diàn)壓高(gāo)于300 V，使得電(diàn)流不要低(dī)于4mA。

推薦使用RTD6137 非變性電(diàn)泳蛋白(bái)質Marker（45-880 kD），RTD6142 高(gāo)分子量非變性電(diàn)泳蛋白(bái)質Marker II（45-669 kD）或者RTD6144 寬分子量非變性電(diàn)泳蛋白(bái)質Marker 21-880 kD。然而由于凝膠濃度較低(dī)，低(dī)于45 kD條帶會(huì)壓在前沿，可能(néng)不可見(jiàn)。

在Blue Native PAGE電(diàn)泳中，不能(néng)使用預染分子量Marker，因為(wèi)所有的預染蛋白(bái)分子量Marker都是經過變性和還(hái)原的，在非變性凝膠上(shàng)不能(néng)良好分離。

請注意，即使使用非變性分子量Marker，在非變性電(diàn)泳中的分子量預估也是非常不精确的，因為(wèi)各蛋白(bái)質的不同電(diàn)荷和結構會(huì)嚴重影響凝膠遷移。為(wèi)獲得更精确的預估，可使用質譜分析或排阻層析（SEC）。

7. 你們推薦對Blue Native PAGE凝膠使用哪種染色方法？

Blue Native PAGE凝膠可兼容大多(duō)數标準Coomassie R-250或G-250染料配方。推薦使用FastBlue蛋白(bái)染色液（貨号：RTD6202）。

8. 5% G-250染料的作用是什麽？是否含有洗滌劑？

5% G-250染料（貨号BC260）是一(yī)種濃縮型Coomassie G-250儲液，專為(wèi)與含有洗滌劑（非離子型）的Blue Native PAGE凝膠電(diàn)泳樣品一(yī)起使用而設計。該染料不含洗滌劑。正常情況下(xià)，非變性蛋白(bái)在凝膠上(shàng)的遷移取決于凝膠緩沖液pH下(xià)的自(zì)然電(diàn)荷/等電(diàn)點，但是，加入Coomassie G-250會(huì)使蛋白(bái)質産生(shēng)負電(diàn)荷，即使是通(tōng)常具有正電(diàn)荷的高(gāo)pI蛋白(bái)質也能(néng)帶上(shàng)負電(diàn)。該添加劑能(néng)夠與蛋白(bái)質非特異性結合，能(néng)夠保持蛋白(bái)的非變性狀态。

9. 你們推薦選擇哪種轉膜緩沖液用于Blue Native PAGE凝膠轉印？

我們推薦選擇10×BN轉膜緩沖液（貨号：BC600P）用于Blue Native PAGE凝膠轉印。PVDF是推薦使用的印迹膜，具有良好的轉印和檢測效果。硝酸纖維素膜（NC膜）不能(néng)兼容Blue Native PAGE凝膠轉印，這是因為(wèi)硝酸纖維素膜可與Coomassie G-250染料發生(shēng)緊密結合，很難脫離幹淨。

10. 對于Blue Native PAGE凝膠，你們推薦的轉膜條件(jiàn)是什麽？

由于Blue Native PAGE電(diàn)泳基本關注的是分子量比較大的蛋白(bái)或複合體，推薦使用濕轉法轉膜，不推薦用半幹轉方法轉膜。使用BN轉膜緩沖液，以下(xià)轉膜條件(jiàn)僅供參考，客戶針對自(zì)己的目的蛋白(bái)，最好經過1-2次預實驗後，确定最佳的轉膜條件(jiàn)。

11. 凝膠轉膜後，我的PVDF膜染上(shàng)藍顔色了怎麽辦？

由于電(diàn)泳緩沖液和上(shàng)樣緩沖液中含有考馬斯亮藍G-250，凝膠轉膜後PVDF膜會(huì)有藍色痕迹，可以把膜浸泡在無水(shuǐ)甲醇中漂洗幾分鍾，去除藍色。

12. 非變性Marker轉到(dào)膜上(shàng)看(kàn)不到(dào)條帶，Western Blot檢測後我如何判斷條帶大小(xiǎo)呢(ne)？

有兩種方法可以解決非變性Marker轉膜後條帶顯示問題：

第一(yī)種方法：凝膠轉膜後用麗春紅(hóng)染色液（貨号：RTD6301）染膜，可以看(kàn)到(dào)Marker條帶，順便可以檢測轉膜效率，然而要注意的是麗春紅(hóng)染色靈敏度比較低(dī)，可能(néng)不能(néng)完全看(kàn)到(dào)完整的Marker條帶。

       注：北(běi)京師(shī)範大學惠贈圖片

第二種方法（下(xià)圖）：電(diàn)泳結束後，把含有Marker泳道的凝膠切下(xià)，單獨用考馬斯亮藍染色液染色（貨号：RTD6202），剩餘的凝膠去完成轉膜到(dào)ECL發光(guāng)檢測過程，最後的發光(guāng)結果和Marker染色結果拼接判斷條帶範圍。