2×CTAB提取緩沖液

● 産品編号及規格：                                             

● 産品介紹：

    CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一(yī)種陽離子去污劑,具有從(cóng)低(dī)離子強度溶液中沉澱核酸與酸性多(duō)聚糖的特性。在高(gāo)離子強度的溶液中(>0.7 M NaCl) CTAB與蛋白(bái)質和多(duō)聚糖形成複合物(wù)而不沉澱核酸。通(tōng)過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白(bái)、多(duō)糖、酚類等雜(zá)質後加入醇（乙醇或異丙醇）沉澱即可使核酸分離出來。

    2×CTAB提取緩沖液成分：2%(w/v，55 mM)CTAB，100 mM Tris (pH 8.0)，20 mM EDTA,1.4 MNaCl,，還(hái)原劑(随用随加) 。

● 儲存及運輸：

   常溫貯存一(yī)年(nián)；常溫運輸。

● 實驗操作步驟：

一(yī) DNA提取：

   1. 2×即用型CTAB提取液配制：

按照(zhào)終濃度0.2% （v/v）加入還(hái)原劑，如1 ml 2×CTAB提取緩沖液中加入2 μl還(hái)原劑。2×即用型CTAB提取液建議現用現配。

2. 材料研磨：

取0.2-0.5克新鮮植物(wù)材料，于液氮中研磨成粉末。

3. 樣品裂解：

按照(zhào)每100 mg研磨粉末使用0.5 ml提取緩沖液的比例将粉末轉入1.5 ml離心管中，立即加入65℃預熱的2×即用型CTAB提取緩沖液，65℃水(shuǐ)浴30分鍾，間歇混勻。

注：提取緩沖液使用量不要超過0.7 ml，否則後續純化不能(néng)在一(yī)個(gè)離心管内完成；CTAB溶液在低(dī)于15℃時會(huì)形成沉澱析出，因此，在将其加入冰冷的植物(wù)材料之前必須預熱，且離心時溫度不要低(dī)于15℃。

4. 離心去雜(zá)質：

14000 g 常溫離心5分鍾，轉移上(shàng)清至新的1.5 ml離心管中。

5. 去除RNA：

上(shàng)清中加入1/100上(shàng)清體積的RNaseA溶液（10 mg/ml）（貨号：RN001），如500 μl上(shàng)清中加如5 μl RNaseA溶液，37℃處理20分鍾。

6. 第一(yī)次抽提純化：

6.1 步驟5溶液中加入等體積的Tris酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），輕緩颠倒離心管混勻8-10次，常溫14000 g 離心10分鍾，保留上(shàng)清。

6.2. 重複抽提一(yī)次。

7. 第二次純化：

上(shàng)清中加入等體積氯仿：異戊醇（24:1），颠倒離心管混勻8-10次，常溫14000 g離心10分鍾，保留上(shàng)層水(shuǐ)相(xiàng)。

8. 沉澱DNA：

8.1 将上(shàng)層水(shuǐ)相(xiàng)轉入新的1.5 ml離心管中，加入0.6倍體積的冰冷異丙醇，輕柔混勻，-20℃靜(jìng)

置30分鍾；

8.2 14000 g4℃離心10分鍾。

9. 漂洗DNA：

9.1 去上(shàng)清液, 加入1ml 70%乙醇漂洗沉澱，4℃14000 g 3分鍾，吸棄乙醇。

9.2 4℃ 14000 g 1分鍾，用移液器(qì)吸盡殘餘乙醇，超淨台吹幹沉澱。

注：沉澱不能(néng)徹底幹燥，否則不好溶解。

10. 貯存DNA：

加入50-100 μl的超純水(shuǐ)或TE緩沖液溶解DNA，-20℃保存備用。

二 RNA提取：

注：以下(xià)程序請注意所有試劑都要保證RNase-free。

1. 2×即用型CTAB提取液（RNase-free，現用現配）配制：

      2×CTAB提取緩沖液中按照(zhào)1/1000體積加入DEPC，如100 ml中加入100 μl DEPC，混勻後過夜處理，高(gāo)溫高(gāo)壓，即為(wèi)2×即用型CTAB提取緩沖液（RNase-free）。按照(zhào)終濃度1 % （v/v）加入還(hái)原劑，如1 ml 2×CTAB提取緩沖液（RNase-free）中加入10 μl還(hái)原劑。2×即用型CTAB提取液建議現用現配。

2. 材料研磨：

取0.2-0.5克新鮮植物(wù)材料，于液氮中研磨成粉末。

3. 樣品裂解：

按照(zhào)每100 mg研磨粉末使用0.5 ml提取緩沖液的比例将粉末轉入1.5 ml離心管中，立即加入65℃預熱的2×即用型CTAB提取緩沖液，65℃水(shuǐ)浴30分鍾，間歇混勻。

注：提取緩沖液使用量不要超過0.7 ml，否則後續純化不能(néng)在一(yī)個(gè)離心管内完成；CTAB溶液在低(dī)于15℃時會(huì)形成沉澱析出，因此，在将其加入冰冷的植物(wù)材料之前必須預熱，且離心時溫度不要低(dī)于15℃。

4. 離心去雜(zá)質：

14000 g 常溫離心5分鍾，轉移上(shàng)清至新的1.5 ml離心管中。

5. 第一(yī)次純化：

上(shàng)清中加入等體積的水(shuǐ)酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），輕緩颠倒離心管混勻8-10次，常溫14000 g 離心10分鍾。

6. 第二次純化：

将上(shàng)清液轉入另一(yī)1.5 ml離心管中，加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），颠倒離心管混勻8-10次，常溫14000 g離心10分鍾。

7. 沉澱RNA：

将上(shàng)層水(shuǐ)相(xiàng)轉入新的1.5 ml離心管中，加入1/2體積7.5 M LiCl（RNase-free）（貨号：LC1030），輕柔混勻，-20℃ 靜(jìng)置30分鍾；14000 g4℃離心10分鍾。

9. 漂洗RNA：

9.1 去上(shàng)清液, 沉澱中加入1ml 70%乙醇（RNase-free），吹打漂洗沉澱，14000 g4℃3分鍾，吸棄乙醇。

9.2 14000 g4℃1分鍾，用移液器(qì)吸盡殘餘乙醇，超淨台吹幹沉澱。

注：RNA沉澱不能(néng)過分幹燥，否則不好溶解。

10. 貯存RNA：

加入50-100 μl的RNase-free水(shuǐ)溶解RNA，-80℃保存備用。