細菌基因組DNA提取試劑盒（目錄号：RTG2401）

● 試劑盒内容及保存：

● 儲存、效期及運輸：

本試劑盒在常溫（25℃左右）幹燥條件(jiàn)下(xià)，可保存1年(nián)；更長(cháng)時間的保存可置于2-8℃。2-8℃保存條件(jiàn)下(xià)，若溶液産生(shēng)沉澱，應在使用前置于37℃下(xià)溶解沉澱至溶液澄清後再使用。單獨包裝的蛋白(bái)酶K、溶菌酶和RNaseA收到(dào)後-20℃保存。

蛋白(bái)酶K、溶菌酶和RNase A濕冰運輸，其餘組份常溫運輸。

● 産品簡介：

本試劑盒采用可以特異性結合DNA的離心吸附柱和獨特的緩沖液系統提取細菌（革蘭氏陽性菌和陰性菌）的基因組DNA。溶菌酶能(néng)有效去除細菌細胞壁；蛋白(bái)酶K能(néng)把核酸解離出來； RNaseA能(néng)去除痕量的RNA污染；離心吸附柱能(néng)夠高(gāo)效、專一(yī)吸附DNA，最大限度去除雜(zá)質蛋白(bái)及細胞中其他有機(jī)化合物(wù)，提取的基因組DNA片段大，純度高(gāo)，質量穩定可靠。

使用本試劑盒回收的DNA可适用于各種常規操作，包括酶切、PCR、文庫構建、Southern雜(zá)交等實驗。

● 提取得率：

● 準備工(gōng)作：

1. 準備55℃和70℃水(shuǐ)浴；無水(shuǐ)乙醇；1.5 ml滅菌離心管。

2. 按照(zhào)标簽所示在去蛋白(bái)液GD和漂洗液PW中加入無水(shuǐ)乙醇，混勻後蓋緊瓶蓋後室溫貯存備用。

3. 每次使用前請檢查緩沖液GA，緩沖液GB和去蛋白(bái)液GD是否有沉澱生(shēng)成，如果出現沉澱，37℃溫浴至沉澱溶解後再使用。

● 操作步驟：

如非指出，所有離心步驟均為(wèi)使用台式離心機(jī)在室溫下(xià)離心。

1. 取細菌培養液1-2 ml，10,000 g離心1分鍾，盡量吸淨上(shàng)清；向細菌沉澱中加入180 μl EB，旋渦混勻後加入18 μl 溶菌酶，室溫放(fàng)置10-15分鍾，期間間歇混勻幾次。

注：溶菌酶的用量和處理時間與處理的細菌種類密切相(xiàng)關，用戶可以根據細菌種類進行調節。如革蘭氏陽性菌應将處理時間延長(cháng)到(dào)30-60分鍾。

2.10,000g離心1分鍾，吸棄大部分上(shàng)清，留下(xià)約10 μl液體，徹底混勻。

   注：由于餘留的液體較少，徹底混勻菌體不太容易，用手指彈動管壁附加槍頭反複吹打既能(néng)完全混勻菌體。混勻一(yī)定要徹底，否則容易導緻步驟8中離心柱堵塞。

3. 向菌體沉澱中加入200 μl緩沖液GA，混勻。

4. 向管中加入20 μl 蛋白(bái)酶K，混勻，55℃處理15-30分鍾，期間間歇混勻2-3次至溶液清亮。

   注：加入蛋白(bái)酶K後會(huì)産生(shēng)絮狀物(wù)，消化徹底的标志(zhì)是絮狀物(wù)完全消失，溶液變清亮。如消化不徹底，會(huì)導緻步驟8中離心柱堵塞。

5. 加入10 μl RNaseA（10 mg/ml）溶液，混勻後室溫放(fàng)置2分鍾。

6. 加入220 μl緩沖液GB，混勻，70℃放(fàng)置10-30分鍾（對于革蘭氏陽性菌，時間應延長(cháng)到(dào)60分鍾）。

注：加入緩沖液GB時可能(néng)會(huì)産生(shēng)白(bái)色沉澱，一(yī)般70℃放(fàng)置相(xiàng)應時間後溶液會(huì)變清亮。如溶液未變清亮，應延長(cháng)70℃處理時間。如果絮狀物(wù)不能(néng)處理幹淨，容易導緻步驟8中離心柱的堵塞。

7. 加入220 μl無水(shuǐ)乙醇，充分混勻。

注：加入乙醇後會(huì)産生(shēng)絮狀沉澱，可用槍頭反複抽打1-2次将沉澱弄碎後再上(shàng)柱。如果絮狀物(wù)未做處理，容易導緻步驟8中離心柱的堵塞。

8. 将上(shàng)一(yī)步所得溶液和絮狀沉澱加入到(dào)吸附柱CG中（吸附柱放(fàng)入收集管中），11,000g離心5分鍾，倒掉廢液，吸附柱CG放(fàng)入收集管中。

注：如果出現吸附柱堵塞現象，可将離心時間延長(cháng)到(dào)10分鍾。

9. 向吸附柱CG中加入500 μl去蛋白(bái)液GD（使用前請先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇），11,000 g離心2分鍾，倒掉廢液，吸附柱放(fàng)入收集管中。

10. 向吸附柱CG中加入700 μl漂洗液PW（使用前請先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇），11,000 g離心60秒(miǎo)，倒掉廢液，吸附柱放(fàng)入收集管中。

11. 向吸附柱CG中加入500 μl 漂洗液PW，11,000 g離心60秒(miǎo)，倒掉廢液。

12. 吸附柱CG放(fàng)回收集管中，11,000 g離心2分鍾。

注：此步驟非常重要，其目的是将吸附柱中殘餘的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響後續的酶反應（酶切、PCR等）實驗。

13. 将吸附柱CG轉入一(yī)個(gè)幹淨的1.5 ml離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50–100 μl經70℃水(shuǐ)浴預熱的洗脫緩沖液EB，室溫放(fàng)置2分鍾，11,000 g離心2分鍾。

注； = ① 洗脫緩沖液體積最好不少于50 μl，體積過小(xiǎo)影響回收效率。

=  ② 洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水(shuǐ)做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5範圍内，pH值低(dī)于7.0會(huì)降低(dī)洗脫效率。

14. DNA産物(wù)-20℃保存。

● DNA濃度及純度檢測：

基因組DNA片段的大小(xiǎo)與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。提取的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電(diàn)泳和紫外分光(guāng)光(guāng)度計檢測濃度與純度。可配制0.8-1.0％瓊脂糖凝膠，使用λ/HindIII判斷基因組的大小(xiǎo)，完整的基因組大小(xiǎo)應在23 kb以上(shàng)。使用分光(guāng)光(guāng)度計檢測時， OD₂₆₀/OD₂₈₀比值應為(wèi)1.7-1.9之間，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水(shuǐ)洗脫，比值可能(néng)偏低(dī)，但并不表明DNA純度不高(gāo)。