明膠酶譜分析試劑盒

      Gelatin Zymography Analysis Kit    Ver.710278

● 産品組成：

● 産品簡介：

基質金屬蛋白(bái)酶（matrix metalloproteinase, MMP）是一(yī)種鋅依賴性酶，能(néng)切割細胞外基質成分，能(néng)在一(yī)定條件(jiàn)下(xià)水(shuǐ)解明膠。細胞内的MMP以無活性的酶原形式分泌，活化後能(néng)夠降解細胞外基質的膠原蛋白(bái)，通(tōng)過影響細胞外基質，參與胚胎發育、形态發生(shēng)、組織重塑等過程，并參與炎症、腫瘤、心血管、神經等許多(duō)疾病過程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9參與各種生(shēng)理與病理過程，其在臨床診斷和治療中的意義日益受到(dào)重視。

本試劑盒采用酶譜法（Zymography）檢測MMP-2、MMP-9 活性，其基本原理和程序是：制備含有膠原酶底物(wù)明膠的SDS-PAGE 凝膠，含蛋白(bái)酶的樣品在此凝膠中進行電(diàn)泳，電(diàn)泳時，SDS與樣本中的MMP可逆性結合，導緻MMP氫鍵和疏水(shuǐ)鍵被破壞而不能(néng)發揮分解明膠的作用。電(diàn)泳結束後取出凝膠與孵育溶液孵育，MMP恢複活性，在其遷移位置水(shuǐ)解凝膠中的明膠，考馬斯亮藍染色後凝膠中由于含底物(wù)蛋白(bái)而被深染，形成深色背景，但在有蛋白(bái)酶條帶的位置，蛋白(bái)酶将降解凝膠中的底物(wù)蛋白(bái)，因而不被染色而形成透亮白(bái)色區域，從(cóng)而能(néng)同時指示MMP-2、MMP-9 的大小(xiǎo)位置（酶譜）及活性，其強弱與MMP活性呈正比。

本試劑盒提供明膠酶譜分析的全套試劑，試劑盒可進行50 次标準膠（8×10 cm）檢測，如果小(xiǎo)膠加樣孔為(wèi)10~15個(gè)，則總計可檢測500~750 個(gè)樣品。試劑盒配套有膠原酶陽性對照(zhào)，可以有效分解明膠，方便判斷凝膠及電(diàn)泳體系是否有問題。

● 貯存及運輸：

    按照(zhào)試劑盒标簽貯存；常溫運輸；開(kāi)封後試劑盒有效期一(yī)年(nián)。

● 使用說明：

1. 10% APS配制-5 ml：

将0.5 gAPS幹粉溶于5 ml滅菌水(shuǐ)中，徹底溶解後分裝，1 ml/支，-20℃備存，每次取一(yī)管使用。10% APS應盡量減少室溫存放(fàng)時間，以防失效。10%APS在4℃有效期為(wèi)一(yī)周，-20℃有效期6個(gè)月(yuè)。若發現凝膠聚合時間延長(cháng)，應考慮更換使用-20度保存的10%APS。

2. 10×明膠底物(wù)配制：

明膠粉末加入30 ml滅菌水(shuǐ)，60℃水(shuǐ)浴中徹底融化，冷卻至常溫後使用。明膠底物(wù)配制後-20℃貯存。

一(yī) 分離膠制備：

1.1參照(zhào)凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。

1.2按照(zhào)表格将不同體積的成分在小(xiǎo)燒杯中混合；最後加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。

1.3在凝膠模具中灌入适量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃闆頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然後在分離膠溶液上(shàng)輕輕覆蓋一(yī)層無水(shuǐ)乙醇，使凝膠表面保持平整。

1.4靜(jìng)置5-10分鍾，待分離膠和乙醇層之間出現一(yī)個(gè)清晰的界面後，說明凝膠已聚合

二 濃縮膠制備：

2.1去除覆蓋在分離膠上(shàng)的乙醇層。

2.2按照(zhào)表格将不同體積成分在一(yī)個(gè)小(xiǎo)燒杯中混合；最後加入10%過硫酸铵和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。

2.3将濃縮膠溶液加至分離膠的上(shàng)面，直至凝膠溶液到(dào)達前玻璃闆的頂端。

2.4将梳子插入凝膠内，避免産生(shēng)氣泡。

2.5靜(jìng)置30-60分鍾，等待濃縮膠聚合（25℃ 标準凝固時間為(wèi)50分鍾）。

注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高(gāo)時，聚合較快；冬天氣溫低(dī)時，聚合時間會(huì)延長(cháng)。可以根據表格标準條件(jiàn)調節催化劑的加入量。

三 電(diàn)泳：

3.1 5×Tris-甘氨酸-SDS電(diàn)泳緩沖液的配制：

   将一(yī)包幹粉全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水(shuǐ)徹底溶解，用水(shuǐ)定容至1 L（此溶液不用調節pH值，pH 8.3-8.5）。電(diàn)泳前将緩沖液稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電(diàn)泳緩沖液。

3.2 樣品處理：融化-混合-上(shàng)樣

3.2.1 将5×蛋白(bái)上(shàng)樣緩沖液（變性，非還(hái)原）常溫融化後混勻。

3.2.2 将上(shàng)樣緩沖液與蛋白(bái)樣品按照(zhào)1:4的比例混勻。

注：由于MMP活性需要二價陽離子，蛋白(bái)樣品中避免使用EDTA、EGTA等二價陽離子鳌和劑以及巯基乙醇和DTT等。

蛋白(bái)樣品提取可以選擇RL0120F RIPA裂解液(強，不含抑制劑，不含螯合劑)

3.2.3 快甩離心收集到(dào)管底，常溫放(fàng)置5-10分鍾，不要加熱處理樣品，上(shàng)樣電(diàn)泳。

     膠原酶陽性對照(zhào)同時上(shàng)樣5-10 μl。

3.3 電(diàn)泳：

   在電(diàn)泳槽的内槽加入1×電(diàn)泳緩沖液，輕輕撥出梳子，沖洗加樣孔，随後在電(diàn)泳槽外槽加入适量的1×電(diàn)泳緩沖液。上(shàng)樣，恒電(diàn)壓150 V電(diàn)泳。

電(diàn)泳條件(jiàn)（一(yī)闆膠）

四 MMP檢測：

4.1 漂洗：

取出凝膠，放(fàng)入容器(qì)内，加入50 ml蒸餾水(shuǐ)漂洗凝膠，搖床慢(màn)搖5分鍾，重複一(yī)次。

4.2 複性：

4.2.1  1×複性緩沖液配制：

将10×複性緩沖液用蒸餾水(shuǐ)稀釋10倍，如10 ml 10×複性緩沖液加90 ml蒸餾水(shuǐ)。

注：如10×複性緩沖液由于低(dī)溫貯存有析出時，37℃徹底溶化後再使用。

4.2.2 複性：

取出凝膠，棄蒸餾水(shuǐ)，加入50 ml 1×複性緩沖液，搖床慢(màn)搖30分鍾。

注：複性結束後，凝膠呈乳白(bái)半透明狀。

4.3 孵育：

4.3.1 1×孵育緩沖液配制：

将10×孵育緩沖液用蒸餾水(shuǐ)稀釋10倍，如10 ml 10×孵育緩沖液加90 ml蒸餾水(shuǐ)。

4.3.2 孵育：

倒掉1×複性緩沖液，加入50 ml 1×孵育緩沖，37℃ 搖床慢(màn)搖10分鍾；

     棄1×孵育緩沖液，加入 50 ml 1×孵育緩沖，37℃ 搖床慢(màn)搖4小(xiǎo)時-過夜孵育。

注：陽性對照(zhào)-膠原酶IV通(tōng)常37℃孵育3-4小(xiǎo)時即可消化凝膠中的明膠。如樣品中MMP 活性低(dī)，應延長(cháng)孵育時間至過夜。

4.4 顯色：

4.4.1 漂洗：倒掉孵育液，凝膠中加入50 ml蒸餾水(shuǐ)，搖床慢(màn)搖5分鍾，重複一(yī)次。

4.4.2 棄蒸餾水(shuǐ)，加入50 ml FastBlue染色液（以剛剛覆蓋過膠面為(wèi)适），搖床上(shàng)常溫搖動30分鍾-2小(xiǎo)時，凝膠大部分區域被深染，在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區域；蒸餾水(shuǐ)漂洗2-3次，每次5-10分鍾。

4.5 拍照(zhào)：

     由于考馬斯亮藍染色，凝膠背景為(wèi)藍色，自(zì)然光(guāng)下(xià)拍照(zhào)效果不好。建議使用凝膠觀察透射燈（貨号：RT3820）底部打光(guāng)拍照(zhào)。

五 實驗示例：

10%分離膠（含明膠底物(wù)）

電(diàn)泳條件(jiàn)：1×TGS 150V 36-12mA 90 min

實驗步驟：

    漂洗：蒸餾水(shuǐ)漂洗兩次；

複性：50 ml 1×複性緩沖液常溫複性30分鍾；

              孵育：50 ml 1×孵育緩沖液37度孵育10分鍾；

              50 ml 1×孵育緩沖液37度孵育15小(xiǎo)時；

漂洗：蒸餾水(shuǐ)漂洗兩次；

              染色：FastBlue染色60分鍾。