RIPA裂解液(強，不含抑制劑，不含螯合劑)

● 産品包裝：

● 産品簡介：

RIPA裂解液(RIPA  Lysis  Buffer)是一(yī)種傳統的細胞組織快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到(dào)的蛋白(bái)樣品可以用于常規的Western、IP等。RIPA的本意是Radio  Immunoprecipitation  Assay。RIPA裂解液的配方有很多(duō)種，根據其裂解液的強度大緻可以分為(wèi)強、中、弱三類。該RIPA裂解液(強)的主要成分為(wèi)50 mM Tris (pH 7.4)，150 mM NaCl，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，不含蛋白(bái)酶抑制劑，不含磷酸酶抑制劑，不含螯合劑如EDTA或EGTA，可适用于明膠酶譜實驗的蛋白(bái)提取。使用前根據實驗需要添加蛋白(bái)酶抑制劑或磷酸酶抑制劑以及EDTA或EGTA。

用該RIPA裂解液裂解得到(dào)的蛋白(bái)樣品，可以用BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒測定蛋白(bái)濃度。由于含有較高(gāo)濃度的去垢劑，不能(néng)用Bradford法測定蛋白(bái)濃度。

● 保存、效期及運輸：

-20℃保存，有效期一(yī)年(nián)，濕冰運輸。

● 注意事(shì)項：

1.為(wèi)取得最佳的使用效果，盡量避免過多(duō)的反複凍融。可以适當分裝後使用。需自(zì)備PMSF。裂解樣品的所有步驟都需在冰上(shàng)或4℃進行。

2. RIPA裂解液的裂解産物(wù)中經常會(huì)出現一(yī)小(xiǎo)團透明膠狀物(wù)，屬常見(jiàn)現象。該透明膠狀物(wù)為(wèi)含有基因組DNA等的複合物(wù)。在不檢測與基因組DNA結合特别緊密的蛋白(bái)的情況下(xià)，可以直接離心取上(shàng)清用于後續實驗；如果需要檢測和基因組結合特别緊密的蛋白(bái)，則可以通(tōng)過超聲處理打碎打散該透明膠狀物(wù)，随後離心取上(shàng)清用于後續實驗。如果檢測一(yī)些常見(jiàn)的轉錄因子，例如NF-kappaB、p53等時，通(tōng)常不必進行超聲處理，就(jiù)可以檢測到(dào)這些轉錄因子。

● 使用說明：

1.  準備RIPA裂解液：

融解RIPA裂解液，混勻；取适當量的裂解液，在使用前數分鍾内加入1/100體積的100 mM PMSF，使PMSF的最終濃度為(wèi)1 mM。

注：進行明膠酶譜實驗提取蛋白(bái)樣品時，不要添加EDTA或EGTA，以免螯合掉MMP活性需要的二價陽離子；蛋白(bái)酶抑制劑也要選擇性添加，不要添加金屬蛋白(bái)酶抑制劑，可以添加PMSF（絲氨酸蛋白(bái)酶抑制劑）。

2. 細胞蛋白(bái)提取：

2.1 貼壁細胞：去除培養液，加入适量1×PBS，輕柔漂洗一(yī)遍，不要擾動貼壁細胞。按照(zhào)6孔闆每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液，移液器(qì)吹打數下(xià)，使裂解液和細胞充分接觸，冰上(shàng)裂解細胞5分鍾，用細胞刮刀刮下(xià)細胞收集于1.5 ml離心管中，冰上(shàng)繼續裂解15分鍾，間歇混勻。

2.2 懸浮細胞：450 g 4℃ 離心5 min收集細胞；用适量1×PBS重懸細胞，450 g 4℃ 離心5 min收集細胞；重複漂洗細胞一(yī)次；按照(zhào)細胞沉澱體積（PCV）20 μl加入200 μl RIPA的比例加入RIPA，混勻細胞沉澱，冰浴處理15分鍾，間歇混勻。

注：2×10⁶ Jurkat細胞，其細胞沉澱體積（PCM，Packed Cell Volume）大約為(wèi)20 μl。

2.3 裂解細胞：

裂解混合物(wù)超聲波處理（超聲條件(jiàn)根據儀器(qì)調整，建議條件(jiàn)為(wèi)）；如沒有超聲破碎儀，可以使用注射器(qì)用27G針頭處理裂解物(wù)10-15次，以徹底裂解細胞。冰浴處理15分鍾。

注：裂解中細胞會(huì)釋放(fàng)出變性的核酸，呈團狀粘稠透明樣，如不進行超聲或針頭裂解處理，會(huì)導緻裂解物(wù)非常粘稠，大大降低(dī)蛋白(bái)提取的得率和純度。

2.4 離心收集上(shàng)清：

充分裂解後，4℃ 16000 g離心10分鍾，取上(shàng)清，即可進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作。

3. 組織樣品蛋白(bái)提取：

3.1 手術(shù)切除的組織塊迅速置于預冷的生(shēng)理鹽水(shuǐ)中，漂洗數次，洗淨組織血迹，用濾紙(zhǐ)吸

幹組織表面液體，将組織切成細小(xiǎo)的碎片。

3.2 按照(zhào)每20 mg組織加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适當添加更多(duō)的裂解液，如果需要高(gāo)濃度的蛋白(bái)樣品，可以适當減少裂解液的用量。)

3.3 用玻璃勻漿器(qì)冰浴勻漿5-10次，收集勻漿後的裂解混合物(wù)，超聲波處理（超聲條件(jiàn)根據儀器(qì)調整，建議條件(jiàn)為(wèi)）；如沒有超聲破碎儀，可以使用注射器(qì)用27G針頭處理裂解物(wù)10-15次，以徹底裂解細胞。裂解物(wù)冰浴處理15分鍾。

注：裂解中細胞會(huì)釋放(fàng)出變性的核酸，呈團狀粘稠透明樣，如不進行超聲或針頭裂解處理，會(huì)導緻裂解物(wù)非常粘稠，大大降低(dī)蛋白(bái)提取的得率和純度。

3.4 充分裂解後，4℃ 16000 g離心10分鍾，取上(shàng)清，即可進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作。