Blue/Clear 非變性凝膠電(diàn)泳試劑盒

   Blue/Clear Native PAGE Electrophoresis Kit 

● 貨品内容：

● 産品簡介：

Blue/Clear Native PAGE（BN/CN-PAGE）是一(yī)種從(cóng)生(shēng)物(wù)樣品（質膜，胞漿等）中分離分子量10 kD-10 M kD 範圍的蛋白(bái)質複合物(wù)的電(diàn)泳技(jì)術(shù)。其原理是用溫和去污劑(如 DDM，digitonin)将蛋白(bái)複合體從(cóng)細胞膜中以近似天然的狀态分離出來，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是用考馬斯亮藍 G-250 代替 SDS與蛋白(bái)結合而使其帶負電(diàn)荷，根據蛋白(bái)分子量不同在 PAGE膠中得到(dào)分離；Clear Native PAGE（CN-PAGE）是電(diàn)泳緩沖液中不加入任何染料，電(diàn)泳中始終保持蛋白(bái)的天然電(diàn)荷和活性狀态，然而，其蛋白(bái)的分辨率要低(dī)于Blue Native PAGE。另外，BN-PAGE由于考馬斯亮藍G-250存在，使蛋白(bái)都覆蓋上(shàng)負電(diàn)荷，可以分離堿性蛋白(bái)（pI＞7）；而CN-PAGE隻适合于酸性蛋白(bái)（pI＜7）的分離。

本産品包括BN/CN-PAGE制膠的所有成分，方便使用。可以用于分離分子量在 10 kD-10M kD 的蛋白(bái)複合體，樣品可以來于胞漿、細胞總裂解液、細胞膜、線粒體膜和葉綠體膜等。電(diàn)泳後可直接用于考染、銀(yín)染、Western 雜(zá)交、SDS-PAGE電(diàn)泳、蛋白(bái)純化、蛋白(bái)活性檢測等分析實驗，也可直接用于電(diàn)洗脫制備蛋白(bái)。

● 運輸和貯存：

本産品常溫運輸；組份按照(zhào)标簽溫度貯存；有效期一(yī)年(nián)。

● 使用說明：

1. 樣品制備：

   該試劑盒不含樣品制備的相(xiàng)關試劑，根據樣品種類選擇不同提取方法。植物(wù)類囊體BN樣品制備可以選擇植物(wù)類囊體膜提取試劑盒（貨号:RTU5002）；動物(wù)總蛋白(bái)BN樣品制備可以選擇動物(wù)胞漿活性蛋白(bái)提取試劑盒(貨号:RTD8106)；動物(wù)膜蛋白(bái)BN樣品制備可以選擇動物(wù)膜蛋白(bái)提取試劑盒（貨号:RTD8111,RTD8112）；動物(wù)線粒體BN樣品制備可以選擇動物(wù)線粒體提取試劑盒（貨号:RTD8115和RTD8116)。

2. 電(diàn)泳：

2.1 拆開(kāi)預制膠包裝，将預制膠安裝在合适的電(diàn)泳槽中。

注：伯樂Mini III或Mini-PROTEAN Tetra Cell，天能(néng)VE-180，六一(yī)24K系列電(diàn)泳槽請确保密封條的安裝方向（下(xià)圖）。

六一(yī)其他系列，君意東方JY-SCZ2/4，百晶BG-verMINI等電(diàn)泳槽可以直接使用預制膠。

不兼容Thermol系列電(diàn)泳槽。

2.2 準備電(diàn)泳緩沖液：

将10×BN/CN PAGE電(diàn)泳緩沖液（幹粉）溶于500 ml滅菌水(shuǐ)中，徹底溶解，測定pH應為(wèi)7.0左右，不要調節pH。用前稀釋10倍即配成1×BN/CN PAGE電(diàn)泳緩沖液。

2.2.1 CN-PAGE電(diàn)泳：

陽極緩沖液和陰極緩沖液均直接使用1×BN/CN PAGE電(diàn)泳緩沖液進行電(diàn)泳。

2.2.2 BN-PAGE電(diàn)泳：

陽極緩沖液使用1×BN/CN PAGE電(diàn)泳緩沖液，陰極緩沖液按照(zhào)下(xià)表配制：

2.3準備樣品：

2.3.1 CN-PAGE電(diàn)泳：

2.3.2 BN-PAGE電(diàn)泳：

2.3.2.1 植物(wù)類囊體膜蛋白(bái)電(diàn)泳：

*植物(wù)類囊體膜蛋白(bái)電(diàn)泳中，含去垢劑樣品中染料加入按照(zhào)以下(xià)原則：

植物(wù)類囊體樣品中G250終濃度為(wèi)去垢劑終濃度的1/4。例如樣品中DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM， n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）終濃度為(wèi)2%，則需要G-250終濃度為(wèi)0.5%。10 μl蛋白(bái)樣品中需要加5% G-250染料1 μl。

2.3.2.2 動物(wù)線粒體BN樣品電(diàn)泳：

*動物(wù)線粒體BN樣品電(diàn)泳中，含去垢劑樣品中染料加入按照(zhào)以下(xià)原則：

2.4電(diàn)泳過程；

2.4.1 CN-PAGE電(diàn)泳：

電(diàn)泳内外槽均使用1×BN/CN PAGE電(diàn)泳緩沖液。在電(diàn)泳槽的内槽内加入1×BN/CN PAGE電(diàn)泳緩沖液(讓電(diàn)泳緩沖液漫過加樣孔)，輕輕撥出預制膠梳子，用1ml吸頭沖洗加樣孔3次，随後在電(diàn)泳槽外槽加入适量的1×BN/CN PAGE電(diàn)泳緩沖液。

2.4.2 BN-PAGE電(diàn)泳：

BN-PAGE電(diàn)泳外槽使用1×BN/CN電(diàn)泳緩沖液；内槽開(kāi)始電(diàn)泳使用的是1×藍色陰極緩沖液，冰浴電(diàn)泳，等待電(diàn)泳指示前沿到(dào)達凝膠1/3處時，将電(diàn)泳緩沖液更換為(wèi)1×BN/CN電(diàn)泳緩沖液，繼續後續電(diàn)泳，因為(wèi)過多(duō)染料會(huì)影響蛋白(bái)在凝膠中的遷移以及蛋白(bái)後續的轉膜實驗。

BN-PAGE電(diàn)泳條件(jiàn)（一(yī)闆膠）

3. 轉膜：

BN-PAGE轉膜必須用PVDF膜，不能(néng)用NC膜，因為(wèi)NC膜與G-250結合非常緊密，不易去除。轉膜後PVDF膜上(shàng)的藍色染料可以用無水(shuǐ)甲醇漂洗去除。轉膜緩沖液推薦使用10×BN轉膜緩沖液（貨号：BC600P）。

4. 染色：

4.1 将電(diàn)泳後的PAGE膠取下(xià)放(fàng)入塑料容器(qì)中，加入适量FastBlue蛋白(bái)染色液或常規考馬斯亮藍染色液（以剛剛覆蓋過膠面為(wèi)适），條帶1-2分鍾即可見(jiàn)。

4.2 搖床常溫搖動10-15分鍾至條帶清晰可見(jiàn)。

4.3 加入适量蒸餾水(shuǐ)脫色，期間更換1-2次蒸餾水(shuǐ)，搖床常溫搖動10-15分鍾至背景幹淨。

4.4 觀察保存結果。

5. 實驗示例：

BN-PAGE 3-12% Precast Gel
穩壓120V 1.5 h 1×BN/CN電(diàn)泳緩沖液 冰浴電(diàn)泳

BN-PAGE 4-16% Precast Gel
恒壓 120V 2 h 1×BN/CN電(diàn)泳緩沖液 冰浴電(diàn)泳

K562 膜蛋白(bái)BN-WB檢測
樣品：膜蛋白(bái)提取樣品用2%DIG和1%DM增溶（ 貨号：RTD8111，動物(wù)膜蛋白(bái)提取試劑盒(細胞)） ，
胞漿蛋白(bái)CY做對照(zhào)
電(diàn)泳：3-12% BN預制膠（貨号：RTD6138-0312），穩壓200V 1×藍色陰極緩沖液至指示前沿距離膠上(shàng)沿2/3處，
更換為(wèi)無色1×BN/CN PAGE電(diàn)泳緩沖液，電(diàn)泳時間共83分鍾
膠預處理：膠浸泡于buffer中（12.5mM Tris，2%SDS，20%甘油，50mM DTT pH6.8），微波煮沸20秒(miǎo)，37度15min後轉膜
轉膜：0.45μm PVDF膜，10×BN轉膜緩沖液（貨号：BC600P）稀釋為(wèi)1×BN轉膜緩沖液加20%甲醇，
恒流200mA  2小(xiǎo)時，未冰浴。
轉膜效果檢測：膜用麗春紅(hóng)染色液染色（貨号：RTD6301）有可見(jiàn)條帶，膠用FastBlue蛋白(bái)染色液染色
（貨号：RTD6202）幾乎無條帶，證明轉膜成功。膜用無水(shuǐ)甲醇清洗5分鍾去除膜上(shàng)藍色殘餘。
封閉：Western快速封閉液（貨号：WR5020）  RT  封閉10 分鍾；
圖1 一(yī)抗：兔單抗GAPDH 1:10000  RT 60min；羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min，ECL曝光(guāng)6秒(miǎo)
圖2 膜使用Western一(yī)抗二抗去除液（弱堿，溫和型）（貨号：WS1200）37度15min，快封10分鍾，
一(yī)抗：兔Na-K ATPase 1:5000  RT 60min，羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min，ECL曝光(guāng)1秒(miǎo)