超濾離心管的使用
注：本文引自(zì)“分子莊園”公衆号，略有修改。
超濾離心管是一(yī)種膜過濾設備，是用于分離液體中不同分子或粒子的裝置。它利用特殊的超濾膜，通(tōng)過應用壓力将液體樣品推動穿過膜，從(cóng)而分離不同分子或粒子的大小(xiǎo)，廣泛用于蛋白(bái)質、DNA和生(shēng)物(wù)分子的濃縮、純化和脫鹽。
一(yī)、超濾與微濾
1、微濾
微濾 (Microfiltration) 涉及利用微孔膜介質去除溶液中尺寸為(wèi) 0.1 μm 至 10.0 μm 的顆粒或生(shēng)物(wù)體。而超濾膜的過濾範圍為(wèi)0.01μm至0.1μm。
微濾膜廣泛應用于生(shēng)物(wù)制藥行業(yè)中的預過濾和除菌過濾。 在細胞實驗中，微濾最常用于樣品和培養基的滅菌（0.1μm微濾膜可去除支原體）。
此外，在核酸和蛋白(bái)質分析之前，使用微濾膜可以有效地從(cóng)細胞裂解物(wù)中去除完整的細胞和細胞碎片。 此步驟對于确保下(xià)遊應用中結果的準确性至關重要。 通(tōng)過微濾，研究人員(yuán)可以獲得純化的樣品，從(cóng)而提高(gāo)核酸和蛋白(bái)質相(xiàng)關研究的靈敏度和特異性。
2、超濾
超濾 (Ultrafiltration) 也是一(yī)種膜過濾，通(tōng)過壓力或濃度梯度等力使料液通(tōng)過半透膜進行分離。 超濾膜能(néng)夠截留尺寸範圍為(wèi)1-1000kDa（MW）的分子，并允許鹽和水(shuǐ)等小(xiǎo)分子通(tōng)過。
超濾是大分子脫鹽、濃縮最方便的方法，已經在蛋白(bái)、抗體、病毒、核酸、囊泡等樣品制備中建立标準操作。與沉澱法相(xiàng)比，超濾法更為(wèi)溫和，避免了可能(néng)導緻生(shēng)物(wù)大分子失活的相(xiàng)變。
水(shuǐ)流的方向垂直于膜的表面，能(néng)最大限度的提高(gāo)水(shuǐ)通(tōng)量，在壓力差的作用下(xià)，水(shuǐ)和小(xiǎo)于膜孔的顆粒或物(wù)質透過膜，大于膜孔的顆粒則被膜截留。死端過濾随著(zhe)過濾時間的延長(cháng)，被截留顆粒将在膜表面形成污染層，阻塞膜孔，使過濾阻力增加，在操作壓力不變的情況下(xià)，膜的過濾透過率将下(xià)降；而增加壓力則可能(néng)是膜破裂。因此，死端過濾隻能(néng)間歇進行，必須周期性地清除膜表面的污染物(wù)層或更換膜。又(yòu)叫錯(cuò)流過濾（cross flow filtration）：水(shuǐ)流的方向平行于膜的表面，可以大量減少污染物(wù)在表面的富集，因為(wèi)水(shuǐ)流會(huì)将其帶走，同時也減少了堵孔的概率，使膜的通(tōng)量能(néng)夠保持，同時，膜上(shàng)面承受的壓力也更小(xiǎo)，可以延長(cháng)膜的使用壽命。錯(cuò)流過濾運行時，水(shuǐ)流在膜表面産生(shēng)兩個(gè)分力，一(yī)個(gè)是垂直于膜面的法向力，使水(shuǐ)分子透過膜面，另一(yī)種是平行于膜面的切向力，把膜面的截留物(wù)沖刷掉。因此，錯(cuò)流過濾的濾膜表面不易産生(shēng)濃差極化現象和結垢問題，過濾透過率衰減較慢(màn)。錯(cuò)流過濾的運行方式比較靈活，既可以間歇運行，又(yòu)可以實現連續運行。
三、超濾離心管
超濾離心管是一(yī)種利用離心力驅動中小(xiǎo)體積溶液通(tōng)過超濾膜，進行快速濃縮、滲濾和緩沖液置換的裝置。 它由蓋子、過濾裝置和離心管組成。
中間的過濾裝置既可用于滲透樣品，也可以用于保留樣品。當目标分子明顯小(xiǎo)于濾膜孔徑時，可使用超濾離心管對大分子污染物(wù)進行除熱源、澄清和分離。目标樣品會(huì)透過濾膜并保留在離心管内。如果目标分子遠(yuǎn)大于膜孔徑，則小(xiǎo)分子污染物(wù)将被濾除，目标分子将集中在過濾裝置中。垂直設計的超濾膜具有更大的有效濾膜表面積，有助于快速的樣本處理，獲得較高(gāo)的樣本回收率（通(tōng)常>90%），并達到(dào)數十倍的濃縮，同時也最大程度降低(dī)了大顆粒或大分子量物(wù)質堵塞濾膜。死體積設計能(néng)有效防止過度離心使樣本幹掉而造成樣本損失。
收集濾出液後，濃縮樣本（截留部分）可通(tōng)過一(yī)個(gè)簡便的倒置（上(shàng)下(xià)反轉）離心步驟而實現高(gāo)效回收。反轉離心回收設計使蛋白(bái)樣品，特别是小(xiǎo)體積樣品得到(dào)高(gāo)效回收，避免槍頭吸取造成的樣品丢失或操作錯(cuò)誤。
超濾管采用切向流過濾技(jì)術(shù)，是一(yī)種以篩分為(wèi)分離原理，以壓力為(wèi)推動力的膜分離過程。用于截留水(shuǐ)中顆粒和大分子物(wù)質，而水(shuǐ)和小(xiǎo)分子物(wù)質則允許透過膜，過濾精度在0.001-0.01μm（分子量1kD-1000kD）範圍内，可有效除去有機(jī)溶劑或者小(xiǎo)分子物(wù)質，相(xiàng)反，也可以截留水(shuǐ)中的微粒、膠體、細菌、熱源及高(gāo)分子聚合物(wù)。選擇超濾離心管需要考慮樣品起始量以及超濾膜的截留分子量(MWCO)。影響截留和産物(wù)回收率的因素有很多(duō)，如分子構象、帶電(diàn)特性、樣品濃度、操作條件(jiàn)等。而且超濾管上(shàng)的截留分子量隻是平均孔徑，實際孔徑是在左右正太分布的。
一(yī)般建議選擇截留分子量要比要濃縮的目标大分子的分子量小(xiǎo)2-3倍的超濾膜，然後根據要處理的樣品體積選擇不同尺寸的超濾離心管。
為(wèi)防超濾膜幹裂和長(cháng)菌，通(tōng)常超濾離心管内會(huì)附帶少量甘油和疊氮化鈉用于保護和儲存，在使用前需潤洗去除。一(yī)般是向超濾裝置中加入純水(shuǐ)、去離子水(shuǐ)或緩沖溶液，離心使溶液完全過膜，然後離心管中的所有液體。如果幹擾仍然存在，可用0.1 M NaOH清洗，再用20％的乙醇清洗，最後用緩沖液或超純水(shuǐ)水(shuǐ)清洗并甩幹。超濾膜一(yī)旦潤濕後就(jiù)需保持濕潤避免變幹直至使用結束，如果預清洗後沒有立即使用，可用20％的乙醇浸泡保存，務必保持濾膜潤濕，防止長(cháng)菌。
5、超濾管的放(fàng)置
超濾管在離心機(jī)中的擺放(fàng)需要符合切向流過濾要求，即水(shuǐ)流方向與膜面平行。
1）水(shuǐ)平轉子
使用水(shuǐ)平轉子時放(fàng)置沒有特殊要求。
水(shuǐ)平轉子又(yòu)稱甩平轉子、蕩平轉子，轉頭靜(jìng)止時，處于轉頭中的離心管中心線與旋轉軸平行，轉頭旋轉加速時，離心管中心線由平行位置逐漸過渡到(dào)垂直位置，即與旋轉軸成90?角。此種轉子主要用于樣品做密度梯度離心，顆粒移動距離長(cháng)，相(xiàng)應離心時間一(yī)般也較長(cháng)，溶液中的組分相(xiàng)對于管壁的位置在離心過程中和離心後不發生(shēng)改變，因此離心效果好，能(néng)夠分離密度差小(xiǎo)的樣品。
2）固定角轉子
使用角轉子時，雙面垂直膜超濾管放(fàng)置方式要求濾膜側向相(xiàng)對。
單面垂直膜要求濾膜膜面朝下(xià)，這樣濾膜才能(néng)發揮切向流的作用。
有尖角的超濾管應使尖角朝上(shàng)以便樣品進入尖角，讓樣品收集更加方便，此外，死體積設計能(néng)有效防止過度離心使樣本幹掉而造成樣本損失。固定角轉子中離心管與轉子的轉軸之間有一(yī)定的角度，角度變化範圍通(tōng)常在14?-45?。此種轉子重心低(dī)，壽命長(cháng)，容量較大，轉速較高(gāo)，能(néng)承受的最大離心力可達800000g，主要用于分離沉降速度有明顯差異的顆粒樣品。顆粒在扇形溶液移動的距離很短，碰到(dào)外壁的顆粒沿著(zhe)管壁滑到(dào)管底，形成沉澱，因此這種轉子能(néng)很快地收集沉澱物(wù)。
6、超濾管的截留分子量和膜孔徑關系
超濾管是一(yī)種膜過濾設備，用于分離液體中不同分子或粒子的裝置。它利用特殊的超濾膜，通(tōng)過應用壓力将液體樣品推動穿過膜，從(cóng)而分離不同分子或粒子的大小(xiǎo)。這種分離過程基于分子截留量，也就(jiù)是膜的孔徑大小(xiǎo)，決定了哪些分子可以通(tōng)過膜，哪些分子被截留在膜上(shàng)。
分子截留量是表示超濾膜的選擇性的重要參數，通(tōng)常以道爾頓（Da）為(wèi)單位，分子截留率表示膜可以截留的最大分子或粒子的大小(xiǎo)。具體來說，如果膜的分子截留率是10kD，則該膜能(néng)夠截留分子量小(xiǎo)于或等于10000的分子，而分子量大于10000的分子将被截留在膜上(shàng)。
道爾頓是用來表示分子質量或原子質量的單位，一(yī)個(gè)分子的道爾頓數值大約等于其相(xiàng)對原子質量或相(xiàng)對分子質量。
截留分子量和孔徑之間的關系是複雜(zá)的。通(tōng)常超濾膜的截留分子量是指在一(yī)定條件(jiàn)下(xià),某些分子量的物(wù)質被膜截留，被截住物(wù)質的最小(xiǎo)分子量即為(wèi)膜的截留分子量，用以表征膜的分離能(néng)力；而孔徑則是反映膜的通(tōng)透性的重要參數。分子量通(tōng)常用單位為(wèi)Dalton(Da)表示，而孔徑大小(xiǎo)通(tōng)常用單位為(wèi)納米(nm)表示。
超濾膜截留的分子量10000、30000、50000 60000、100000、200000、300000、500000、1000000，對應超濾膜孔徑(μm) 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.1。也就(jiù)是說100kd（10萬）的截留分子量對應50nm的孔徑。
從(cóng)數據上(shàng)看(kàn),似乎存在一(yī)種對應關系，如超濾膜截留分子量為(wèi)100kD（10萬）時,對應的孔徑為(wèi)0.05μm。但這種關系并不完全準确。因為(wèi)超濾膜的孔徑和分子量的關聯并非簡單的線性關系，對于具體的過濾器(qì)或分離膜，其材料、制備方法、孔徑大小(xiǎo)分布等因素都會(huì)影響它們之間的關系。
7、超濾管的離心
超濾管如果離心轉速過高(gāo)，可能(néng)會(huì)導緻膜甚至管子的破裂，做實驗時要根據不同品牌超濾管的說明書中明确指出的最大轉速和離心力，調整離心轉速到(dào)超濾管的承受範圍内。
離心機(jī)的轉速與離心機(jī)的半徑以及離心力都有關系，不同半徑的離心機(jī)，相(xiàng)同轉速出來的離心力也不一(yī)樣。離心力g和rpm（轉／min）轉換公式：g=r×11.8×10??×rpm2，其中g有時用相(xiàng)對離心力（RCF）表示。
r 為(wèi)有效離心半徑，即從(cóng)離心機(jī)軸心到(dào)離心管底的長(cháng)度，單位為(wèi)厘米（cm）。
8、超濾管使用建議
1）超濾管不能(néng)進行高(gāo)壓滅菌，可使用70%乙醇或環氧乙烷滅菌。
2）超濾管一(yī)般不建議重複使用超過5次。受到(dào)樣品性質的影響，先用0.1M的NaOH浸泡1-2h，然後用20%乙醇清洗，最後用超純水(shuǐ)或緩沖液清洗3次，即可再用。
3、如果樣品是線性蛋白(bái)，需使用較低(dī)的離心速度和時間避免蛋白(bái)降解。
4、濃縮過快或者過度濃縮可能(néng)會(huì)引起蛋白(bái)沉澱。建議蛋白(bái)濃縮後最終濃度不超過20mg/ml，同時降低(dī)離心速度并改用截留分子量更大的超濾管。
建議的改進方法是：①離心力降為(wèi)推薦離心力的30%-50%；②改用截留分子量大的超濾管(如原本選用10kD，此時可以選擇30kD)；③取出超濾管, 用吸頭反複吹吸幾次後再繼續濃縮。
6、過濾速率受到(dào)超濾管MWCO，樣品濃度，粘度，離心力和溫度的影響。如果樣品中固體含量超過5%，離心時間需要增加。當在4℃下(xià)運行時，流速大約比25℃時慢(màn)1.5倍。粘性溶液(如50%甘油)的濃縮時間大概是常規溶液的5倍。
7、如果要用超濾的方法分離兩種蛋白(bái)，按照(zhào)經驗，兩個(gè)蛋白(bái)的分子量要相(xiàng)差一(yī)個(gè)數量級（10 倍）。
8、擔心濃縮過程中目的蛋白(bái)和超濾膜之間可能(néng)存在非特異性吸附，可嘗試以下(xià)操作：①确保蛋白(bái)濃度不要過低(dī)；②盡量選用纖維素的低(dī)吸附超濾；③選用小(xiǎo)體積超濾管，通(tōng)過減小(xiǎo)膜面積來降低(dī)非特異性吸附；④使用前可以先對膜進行封閉：1%脫脂奶粉，1%BSA，5%Tween 20，5%SDS，5%TritonX-100，5%PEG3000（不影響蛋白(bái)活性，不影響蛋白(bái)後續使用的前提下(xià)）。
9、對于有些樣品含量非常少的情況，可嘗試一(yī)下(xià)操作：①盡量選擇較小(xiǎo)的截留分子量的超濾管；②選擇帶有尖角收集器(qì)的超濾管以便最大限度回收樣品；③使用水(shuǐ)平轉子優于角轉子；④濃縮完用緩沖液清洗多(duō)次回收, 注意移液器(qì)的槍頭不要碰到(dào)膜，以免膜破裂；⑤使用前可以先對膜進行封閉。