Tris緩沖液介紹
Tris-HCl緩沖液
注：原文為(wèi)“龍師(shī)兄實驗室”公衆号原創，略有修改。
Ver 730464
在生(shēng)化實驗中，除了常用的PB和PBS緩沖液，還(hái)經常用到(dào)THB和TBS緩沖液，那什麽是THB和TBS？ THB是Tris-HCl Buffer的縮寫，中文翻譯為(wèi)“Tris-鹽酸緩沖液”，依靠Tris(堿)和HCl(酸)對溶液起到(dào)緩沖維持溶液pH值的作用。實驗室經常稱呼為(wèi)Tris緩沖液或者Tris-HCl緩沖液，下(xià)文統一(yī)稱呼為(wèi)Tris緩沖液。
TBS是Tris Buffered Saline 的簡寫，中文通(tōng)常稱為(wèi)“三羟甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液”，更準确地譯名應該是“三羟甲基氨基甲烷緩沖生(shēng)理鹽水(shuǐ)”，是生(shēng)化實驗廣泛使用的一(yī)種緩沖溶液。通(tōng)常是在THB的基礎上(shàng)加入0.9% NaCl（0.15 M），擁有和人體體液類似的滲透壓。常用于清洗免疫染色的組織或Western Blotting中的蛋白(bái)印迹膜等。有時為(wèi)了滿足其它需求，需加入Tween-20，這就(jiù)是常用的TBST（TBS with Tween-20）緩沖液。
Tris的曆史：
Tris初次引起廣泛注意的商業(yè)成功之一(yī)是在魚的運輸時降低(dī)了魚的死亡率。在20世紀40年(nián)代，活魚是在盛有海水(shuǐ)的桶裡(lǐ)運往市(shì)場的。不幸的是，許多(duō)魚因CO2的積聚使pH下(xià)降而緻死。為(wèi)了解決這個(gè)問題，在水(shuǐ)中加入麻醉劑以便使魚的代謝活動降至最低(dī)限度，即使這樣也隻能(néng)部分地得到(dào)緩解。1958年(nián)，McFarland和Norris在海水(shuǐ)中加入Tris穩定其pH，的确降低(dī)了魚的死亡率。Tris有很高(gāo)的緩沖能(néng)力，在水(shuǐ)中溶解度高(gāo)，對很多(duō)酶反應是惰性的，Tris也成了用于許多(duō)生(shēng)化目的非常滿意的緩沖液，也是目前用于分子克隆中大多(duō)數酶反應的标準緩沖液。
緩沖pH範圍:
Tris為(wèi)弱堿，在常溫（25℃）下(xià)，它的pKa為(wèi)8.1，根據緩沖理論，Tris緩沖液的有效緩沖範圍在pH 7.1到(dào)9.1之間。0.1 M的水(shuǐ)溶液pH為(wèi)10.4，一(yī)般加入鹽酸以調節pH值，即可獲得所需pH值的緩沖液。但同時應注意溫度對于Tris的pKa的影響對于 Tris 緩沖液，溫度每降低(dī) 1℃，pH 增加約0.03 個(gè)單位，濃度每稀釋 10 倍，pH 降低(dī) 0.03-0.05 個(gè)單位。對于精确應用，使用帶有玻璃/甘汞複合電(diàn)極的經仔細校正的 pH 計。
Tris緩沖液的優點：
1.Tris為(wèi)弱堿，可以隻用一(yī)種緩沖體系配制pH範圍由酸性到(dào)堿性的大範圍pH值的緩沖液，應用範圍廣。
2. Tris緩沖液對生(shēng)物(wù)化學過程幹擾很小(xiǎo)，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發生(shēng)沉澱。
3. Tris在水(shuǐ)中溶解度高(gāo)，對很多(duō)酶的反應是惰性的。
4. Tris緩沖能(néng)力高(gāo)，在pH7.5-9.0之間有較強的緩沖能(néng)力。
5. Tris緩沖劑應用廣，在生(shēng)物(wù)化學、分子生(shēng)物(wù)學、體外診斷、化妝品、塗料等領域發揮重要作用。
Tris緩沖液的缺點：
1.在常溫（25℃）下(xià)，Tris的pKa為(wèi)8.1；根據緩沖理論，Tris緩沖液的有效緩沖範圍在pH7.1到(dào)9.1之間。實際操作中，在pH值小(xiǎo)于7.5和大于9.0時，Tris的緩沖能(néng)力是非常低(dī)的。
2.Tris緩沖液的pH值受溫度影響大，△pKa/℃＝-0.031 ，例如：4℃時緩沖液的pH=8.4，則37℃時的pH=7.4，所以一(yī)定要在使用溫度下(xià)進行配制，室溫下(xià)配制的Tris-HCl緩沖液不能(néng)用于0-4℃。
3.濃度對Tris解離有顯著影響。例如，10 mM和100 mM Tris溶液的pH值會(huì)相(xiàng)差0.1pH單位，溶液的濃度越大則其pH值越高(gāo)。
4.Tris作為(wèi)伯胺，在一(yī)定程度上(shàng)與各種分子反應，包括RNA酶抑制劑，醛，酶，DNA以及常見(jiàn)金屬如Cr2+，Fe3+，Ni2+，Co2+和Cu2+等，在有些系統中會(huì)起抑制作用，在配制過程中需考慮與其他組分之間的相(xiàng)互作用。
5. Tris緩沖液易吸收空氣中的CO2，配制的緩沖液要注意蓋嚴密封。
6. Tris與許多(duō)類型含有亞麻纖維接頭的pH電(diàn)極起反應，這種影響表現在電(diàn)動勢(emf)漂移，平衡時間加長(cháng)。因此，具有亞麻纖維接頭的電(diàn)極不能(néng)精确測定Tris溶液的pH值。隻能(néng)使用具有陶瓷或玻璃接頭的電(diàn)極測定Tris溶液的pH值。
7. Tris對許多(duō)哺乳動物(wù)有毒性。吸入、攝入、皮膚吸收Tris可造成傷害，操作時需戴好手套和護目鏡；
8. 作為(wèi)蛋白(bái)緩沖液時，若後續工(gōng)作需要質譜，則不适宜用Tris，需換成其他質譜儀可耐受的緩沖液。
各種與Tris相(xiàng)關緩沖液的配制方法:
一(yī)、1×TBS的配制
1× TBS ( pH7.4 ) 的配制（0.02 M Tris，0.15 M NaCl，pH7.4）：2.4 g Tris ( 三羟甲基胺基甲烷 )，8.76 g NaCl ，950 ml超純水(shuǐ)， 磁力攪拌下(xià)滴加濃HCl至pH為(wèi)7.4，再加超純水(shuǐ)定容至1000 ml，即可。如需含0.1% Tween-20，則在滴加HCl前先加入1ml Tween-20。
二、THB的配制
Tris-HCl緩沖液的兩種配置方法：
第一(yī)種方法是用Tris-HCl粉末（MW 157.6）和Tris粉末（MW 121.14）按照(zhào)不同比例混合，用水(shuǐ)溶解即配成不同pH的Tris-HCl緩沖液。
另外一(yī)種方法是隻用Tris粉末，用鹽酸調節需要的pH值：以配置1 L 0.1 M的Tris-HCl緩沖液為(wèi)例：先稱12.11 g Tris堿溶于950 mL超純水(shuǐ)中，邊攪拌邊滴加濃鹽酸，用pH計測定溶液所需的pH值，然後再加水(shuǐ)補足到(dào)1 L即可。
配制50 mM Tris-HCl緩沖液 1升配制方法：
溫度對 50 mM Tris-HCl液pH值的影響
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4℃
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25℃
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37℃
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8.1
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7.5
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7.2
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8.2
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7.6
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7.3
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8.3
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7.7
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7.4
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8.4
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7.8
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7.5
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8.5
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7.9
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7.6
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8.6
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8.0
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7.7
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8.7
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8.1
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7.8
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8.8
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8.2
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7.9
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8.9
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8.3
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8.0
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三、TBST緩沖液
TBST是TBS + Tween的縮寫，含有Tris-HCl，NaCl，Tween-20，是做Western Blot常用的一(yī)種洗膜緩沖液，1×TBST濃度為(wèi)0.02 M Tris，0.15 M NaCl，0.1% Tween-20，pH7.4。WB實驗中，為(wèi)了防止曝光(guāng)圖背景太高(gāo)，在孵育時，混有Tween 的TBST 能(néng)洗掉PVDF膜上(shàng)非特異性吸附的蛋白(bái)質。Tween是一(yī)種離子表面活性劑，有複性抗原作用，可提高(gāo)抗體特異性結合。TBST緩沖液于室溫儲存，若溫度過低(dī)，會(huì)産生(shēng)沉澱，可溶解或加熱後使用。
四、TE緩沖液
TE緩沖液是Tris-HCl緩沖液 + EDTA，1×TE濃度為(wèi)10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA pH8.0。為(wèi)使用方便，TE緩沖液也可以配成10×或50×濃度。TE緩沖液是弱堿性，對DNA的堿基有保護作用，因此，DNA在TE中的穩定性較好，不易被破壞完整性或産生(shēng)開(kāi)環及斷裂，TE緩沖液被用于DNA的穩定和儲存。
五、TAE緩沖液
TAE緩沖液是将TE緩沖液中的鹽酸換成乙酸（Tris/Acetate/EDTA），50×TAE濃度為(wèi)2 M Tris-醋酸，100 mM EDTA，~pH8.5。TAE是使用最廣泛的緩沖系統。其特點是超螺旋電(diàn)泳時更符合實際相(xiàng)對分子質量，且雙鏈線狀DNA在其中的遷移率較快，電(diàn)泳大于13 kb的片段時用TAE緩沖液将取得更好的分離效果，此外，回收DNA片段時也建議用TAE緩沖系統進行電(diàn)泳。但是，TAE的缺點是緩沖容量弱，長(cháng)時間電(diàn)泳不建議使用。
六、TBE緩沖液
TBE緩沖液是将TE緩沖液中的鹽酸換成硼酸（Tris/Borate/EDTA），5×TBE濃度為(wèi)445 mM Tris-硼酸，10 mM EDTA，~pH8.3。TBE緩沖液常用于丙烯酰胺電(diàn)泳以及瓊脂糖凝膠電(diàn)泳。TBE可用于長(cháng)時間電(diàn)泳，對較小(xiǎo)片段分離效果較好。但是，超螺旋在TBE緩沖液中電(diàn)泳時測出的相(xiàng)對分子質量會(huì)稍大于實際分子質量。另外，有文獻報(bào)道，硼酸會(huì)影響DNA的連接，如果要進行凝膠回收的話，盡量不使用TBE緩沖液。