分光(guāng)光(guāng)度計 260/280 260/230 比值所代表意義

分光(guāng)光(guāng)度計 260/280 260/230 比值所代表意義

核酸在波長(cháng) 260 nm 處有最高(gāo)吸收峰。 吸收紫外光(guāng)的性質是嘌呤環和嘧啶環的共轭雙鍵系統所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一(yī)切含有它們的物(wù)質，不論是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光(guāng)的特性。但紫外法不能(néng)區分 DNA 和 RNA，隻能(néng)用來鑒定核酸的純度和含量。 蛋白(bái)質由于含有芳香氨基酸，因此也能(néng)吸收紫外光(guāng)。通(tōng)常蛋白(bái)質的吸收高(gāo)峰在 280nm 波長(cháng)處，在 260nm 處的吸收值為(wèi)核酸的十分之一(yī)或更低(dī)，故核酸樣品中蛋白(bái)質含量較低(dī)時對核酸的紫外測定影響不大。 RNA 的 260nm 與 280nm 吸收的比值在 2.0 以上(shàng)；DNA 的 260nm 與 280nm 吸收的比值則在 1.9 左右。當樣品中蛋白(bái)質含量較高(gāo)時260/280的比值即下(xià)降。如何避免吸光(guāng)值漂移讀(dú)數不穩定可能(néng)是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高(gāo)的儀器(qì)， 表現出的吸光(guāng)值漂移越大。事(shì)實上(shàng)， 分光(guāng)光(guāng)度計的設計原理和工(gōng)作原理，允許吸光(guāng)值在一(yī)定範圍内變化，即儀器(qì)有一(yī)定的準确度和精确度。

1.核酸本身物(wù)化性質：溶解核酸的緩沖液的 pH 值、離子濃度等在測試時，離子濃度太高(gāo)也會(huì)導緻讀(dú)數漂移，因此建議使用 pH 值一(yī)定、離子濃度較低(dī)的緩沖液（如 TE）可大大穩定讀(dú)數。 核酸的吸光(guāng)值受 pH 值和緩沖液離子濃度影響。 隻有在一(yī)定的 pH 值和低(dī)離子濃度的條件(jiàn)下(xià)（如 10 mM Tris-HCl pH 8.0 ），才能(néng)得到(dào)精确的檢測結果。水(shuǐ)的 pH 值不穩定，可能(néng)導緻檢測誤差。一(yī)些緩沖液在紫外範圍内存在自(zì)身吸收，為(wèi)了确保準确測量，請使用與懸浮或洗脫樣品時相(xiàng)同的緩沖液。

2.樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素，由于樣品中不可避免存在一(yī)些細小(xiǎo)的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小(xiǎo)顆粒的存在幹擾測試效果。為(wèi)了最大程度減少顆粒對測試結果的影響，要求核酸吸光(guāng)值至少大于 0.1A  ，吸光(guāng)值最好在 0.1-1.5 A 。在此範圍内，顆粒的幹擾相(xiàng)對較小(xiǎo)，結果穩定。從(cóng)而意味著(zhe)樣品的濃度不能(néng)過低(dī)，或者過高(gāo)（超過光(guāng)度計的測試範圍）。

3.操作因素：如混合要充分，否則吸光(guāng)值太低(dī)， 甚至出現負值；混合液不能(néng)存在氣泡，空白(bái)液無懸浮物(wù)，否則讀(dú)數漂移劇烈；必須使用相(xiàng)同的比色杯測試空白(bái)液和樣品， 否則濃度差異太大； 換算(suàn)系數和樣品濃度單位選擇一(yī)緻；不能(néng)采用窗(chuāng)口磨損的比色杯；樣品的體積必須達到(dào)比色杯要求的最小(xiǎo)體積等多(duō)個(gè)操作事(shì)項。

各波長(cháng)具體含義及相(xiàng)關問題

1. A260nm 是核酸最高(gāo)吸收峰的吸收波長(cháng)，最佳測量值的範圍為(wèi) 0.1 至 1.0。如果不在此範圍，稀釋或濃縮樣品，使之在此範圍内；如果吸光(guāng)度小(xiǎo)于 0.05 ，檢查是否存在操作因素（如移液不準确，樣品内有懸浮物(wù)等）影響。DNA 樣品的 A260  吸光(guāng)度值是否 >0.1。（請注意，這個(gè)值跟儀器(qì)無關，核酸的吸光(guāng)度必需大于 0.1，其值才有效和可靠，因為(wèi)樣品中的雜(zá)質和顆粒這些不純物(wù)的幹擾通(tōng)常會(huì)對光(guāng)有一(yī)定吸收，其值 <0.1 ）；

2. A280nm是蛋白(bái)最高(gāo)吸收峰的吸收波長(cháng)， A260/A280比值可進行核酸樣品純度評估： 純 DNA 的 A260/A280 比值為(wèi) 1.8， 純 RNA為(wèi) 2.0。如果比值低(dī)，表示受到(dào)蛋白(bái)（芳香族）或酚類物(wù)質的污染，需要純化樣品。

3. A230nm 是碳水(shuǐ)化合物(wù)最高(gāo)吸收峰的吸收波長(cháng)，比值可進行核酸樣品純度評估：純 DNA 和 RNA 的A260/A230 比值為(wèi) 2.5。若比值小(xiǎo)于 2.0 标明樣品被碳水(shuǐ)化合物(wù)（糖類）、鹽類或有機(jī)溶劑污染，需要純化樣品。 A230 産生(shēng)負值主要是由于在很低(dī) DNA  濃度的溶液中的一(yī)些其他成分的幹擾所導緻的。 在下(xià)一(yī)個(gè)測定中，需要降低(dī)樣品的稀釋度， A230 的負值會(huì)被校正。

4. A320nm 或 A340nm 為(wèi)檢測溶液樣品的濁度和其他幹擾因子。 該值應該接近 0.0。如果不是，說明溶液中有懸浮物(wù)， 需要純化樣品。純樣品的 A320 一(yī)般是 0。

5. A260/A280 和 A260/A230 是核酸純度的指示值。純度好的 DNA 或 RNA，在 pH7-8.5  下(xià) A260 / A280 的比值應該在 2.0  或 2.5。純淨的樣品A260 / A280比值大于 1.8（DNA）或者 2.0（RNA ）。如果比值低(dī)于 1.8  或者 2.0，表示存在 蛋白(bái)質 或者酚類物(wù)質的影響。 A230 表示樣品中存在一(yī)些污染物(wù)，如碳水(shuǐ)化合物(wù)、鹽（胍鹽）等，較純淨的核酸 A260/A230的比值大于 2.0  。當 260/230<1 時，隻有兩種情況。一(yī)是胍鹽污染，二是蛋白(bái)污染。當 0.5％BSA 蛋白(bái)質污染時，蛋白(bái)污染會(huì)導緻 260 和 280 的數值都下(xià)降，但 260/280 的比值變化并不顯著（即是說比值可能(néng)也在1.7-1.8）。但蛋白(bái)殘留會(huì)導緻 230 的數值顯著上(shàng)升，顯著降低(dī) 260/230 的比值。也就(jiù)是說，如果 RNA 樣品的 260/280 ＝1.7，260 /230 ＝0.5，那麽就(jiù)應該考慮污染原因不是胍鹽殘留，而是蛋白(bái)殘留 。

6. 其他：用分光(guāng)光(guāng)度計 測量核酸樣品 時，應該用有緩沖能(néng)力pH8.0的10mM Tris-HCl 溶解核酸樣品，不應該用水(shuǐ)，用水(shuǐ)稀釋核酸樣品會(huì)造成 A260/A280 比值下(xià)降。原因是低(dī)離子強度和低(dī) pH 溶液會(huì)增加 280 nm 處的光(guāng)吸收值。