Western一(yī)抗二抗去除液（弱堿，溫和型）

● 産品簡介：

Western一(yī)抗二抗去除液（弱堿，溫和型）(Western Antibody Stripping Buffer，weak alkaline，mild type)可以高(gāo)效去除印迹膜上(shàng)的一(yī)抗和二抗，而吸附在膜上(shàng)的抗原基本不受影響，用于Western中轉移了蛋白(bái)膜的重複利用，可以轉一(yī)次膜，做多(duō)次Western印迹實驗，通(tōng)常可以重複利用膜5-8次（PVDF膜）。使用本試劑隻需大約30分鍾即可實現蛋白(bái)膜的重複使用，然後可以進行Western的後續操作。

該産品具有以下(xià)幾個(gè)優點：

1.可用于昂貴或珍稀樣本的多(duō)次雜(zá)交；

2.有利于用不同抗體分析單次印迹上(shàng)的不同蛋白(bái)，比如不同亞型的抗體；

3.有利于對異常結果進行重新分析或确認；

4.有利于糾正孵錯(cuò)的抗體；

5.節約試劑成本，并節約時間。

各種去除液的選擇請點擊Western一(yī)抗二抗去除液選擇指南(nán)。

● 貯存：

   常溫貯存，有效期一(yī)年(nián)；常溫運輸。

● 用前必讀(dú)：

1. 理想的抗體去除液應該是洗脫抗體的同時，不洗脫膜上(shàng)結合的蛋白(bái)或者不改變抗原的結合性質，但是目前沒有一(yī)種去除液可以做到(dào)隻洗脫抗體，而完全不洗脫膜上(shàng)結合的抗原；也沒有一(yī)種去除液可以适用于所有不同親和度的抗原抗體複合物(wù)。去除液洗脫能(néng)力太強，抗原也容易被洗脫；太弱，則抗體殘留太高(gāo)。因此，從(cóng)免疫印迹膜上(shàng)去除抗體的方案僅能(néng)用于定性用途，因為(wèi)在每個(gè)抗體清除循環中，或多(duō)或少都将洗去少量膜上(shàng)的蛋白(bái)。

2. PVDF膜比硝酸纖維素膜（NC膜）更堅韌，因此優先推薦使用PVDF膜用于涉及抗體剝離的實驗。

3. 從(cóng)SDS-PAGE凝膠轉印完成後立即幹燥PVDF膜或NC膜，可改善蛋白(bái)質與膜的結合，特别推薦用于涉及多(duō)次抗體剝離的實驗。在第一(yī)輪抗體檢測之前，必須使用甲醇将幹燥的PVDF膜潤濕或用1×TBST将幹燥的NC膜潤濕。已經結合有抗體的膜，決不能(néng)使得膜幹燥，否則抗體分子将與膜結合緊密，很難剝離。因此，在做完一(yī)輪ECL發光(guāng)檢測實驗後，需要用清除液清除掉膜上(shàng)的抗體，推薦将膜浸泡于1×TBS（非1×TBST）中4度保存。

4. 檢測時，優先檢測低(dī)豐度抗原：先孵育條帶較弱（表達較低(dī)）的蛋白(bái)，再孵育條帶明顯（表達較高(gāo)）的蛋白(bái)，最後再孵育内參。

5. 如條件(jiàn)允許，下(xià)一(yī)輪的抗體雜(zá)交實驗選擇種屬來源不同的一(yī)抗（對應不同種屬的二抗），減少檢測的交叉反應。

6. 該清除液适用于ECL發光(guāng)檢測的膜上(shàng)抗體清除，不适合于膜上(shàng)直接顯色（DAB，BCIP/NBT等），不适合熒光(guāng)檢測。

● 使用說明：

1. 在完成Western化學發光(guāng)檢測後，NC膜或PVDF膜用适量蒸餾水(shuǐ)中震蕩漂洗5分鍾；重複漂洗2次。

2. 棄蒸餾水(shuǐ)，加入适量的Western一(yī)抗二抗去除液，根據下(xià)表操作。孵育溫度和時間會(huì)明顯影響抗體去除效果，參照(zhào)下(xià)表調整。

3. 棄去除液，加入足量蒸餾水(shuǐ)，在搖床上(shàng)漂洗2次，每次5分鍾，把去除液徹底漂洗幹淨。

  注：殘餘的去除液會(huì)影響後續抗原抗體的的結合。

4. 可選步驟：漂洗後的轉印膜孵育ECL發光(guāng)液，檢測二抗的清除效率。曝光(guāng)5-10分鍾，膜上(shàng)看(kàn)不到(dào)發光(guāng)條帶表明二抗清除得比較幹淨。如果膜上(shàng)能(néng)看(kàn)到(dào)條帶，重複步驟2-3。

5．繼續進行Western的後續操作（封閉-抗體孵育-發光(guāng)檢測）。

   注：建議每次膜剝離後都要進行重新封閉，以降低(dī)背景。

● 實驗示例：

樣品：K562細胞,SDS裂解液（貨号：RL1060）提取總蛋白(bái)；

電(diàn)泳：4-20% RealPAGE預制膠（貨号：RTD6117-0420）電(diàn)泳

轉膜：NC膜，1×RealBlot快速轉膜液（貨号：RT5020）快速濕轉，恒流400 mA 30 min

圖1：Western快速封閉液（貨号：WR5020）RT 快封  15 min；一(yī)抗：β-Actin鼠單抗 1:10000  RT 60min；二抗：羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min；ECL（貨号：EC2520）曝光(guāng)1秒(miǎo)。

圖2： Western一(yī)抗二抗去除液（弱堿，溫和型） RT 20分鍾剝離，ECL曝光(guāng)11分鍾，二抗去除幹淨。

圖3： Western快速封閉液（貨号：WR5020）RT 快封20分鍾；一(yī)抗：PCNA鼠單抗1：5000 RT 60min，二抗羊抗鼠IgG-HRP 1:5000，ECL（貨号：EC2520）曝光(guāng)1秒(miǎo)。

圖4： 膜第二次剝離RT 30分鍾，ECL自(zì)動曝光(guāng)11min ，二抗去除幹淨

圖5： Western快速封閉液（貨号：WR5020）RT 快封30min；一(yī)抗：GAPDH兔多(duō)抗 1:3000 60min，二抗：羊抗兔IgG-HRP RT 60min，ECL曝光(guāng)2分16秒(miǎo)。

Western一(yī)抗二抗去除液（弱堿，溫和型） PVDF膜測試

樣品：K562細胞,SDS裂解液(貨号：RL1060)提取總蛋白(bái)

電(diàn)泳條件(jiàn)：12% RealPAGE預制膠（貨号：RTD6117-0012）， 恒壓150 V 1×TGS  73 min

轉膜條件(jiàn)：PVDF膜 孔徑0.45μm，1×RealBlot快速轉膜液（貨号：RT5020） 恒流400 mA 30 min

封閉：無蛋白(bái)快速封閉液（貨号：PF1070）常溫封閉10 min

膜去除抗體程序：37度，搖床60rpm 10分鍾

圖1：一(yī)抗：PCNA鼠單抗 1:5000，RT 60min；二抗：羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min，ECL曝光(guāng)1秒(miǎo)

圖2：膜第1次清除後抗體去除效果檢測：膜水(shuǐ)漂洗3次，加入5 ml抗體去除液去除抗體，TBST漂洗3次，ECL曝光(guāng)5分鍾，膜上(shàng)幾乎無可見(jiàn)條帶，說明二抗去除幹淨。

圖3：膜第1次清除後，H3檢測： H3鼠單抗 1:10000  RT  60 min孵育，羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵育，ECL曝光(guāng)5秒(miǎo)。

圖4：膜第2次清除後，GAPDH檢測： GAPDH兔多(duō)抗 1:3000  RT 60 min孵育，羊抗兔IgG-HRP 1:5000  RT 60min，ECL曝光(guāng)150秒(miǎo)。

圖5：膜第3次清除後，PCNA檢測：PCNA鼠單抗 1:5000  RT  60 min孵育，羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵育，ECL曝光(guāng)1秒(miǎo)。