Western一(yī)抗二抗去除液（中性，劇烈型）

● 産品組成：

● 産品簡介：

Western抗體去除液（中性，劇烈型）(Western Antibody Stripping Buffer，neutral，harsh type)可以高(gāo)效去除印迹膜上(shàng)的一(yī)抗和二抗，而吸附在膜上(shàng)的抗原基本不受影響，用于Western中轉移了蛋白(bái)的膜的重複利用，可以轉一(yī)次膜，做多(duō)次Western印迹實驗，通(tōng)常可以重複利用膜2-3次。使用本試劑隻需大約20-30分鍾即可實現蛋白(bái)膜的重複使用，然後可以進行Western的後續操作。以每次使用5 ml Western抗體清除液計算(suàn)，本産品可以使用20次。

該産品具有以下(xià)幾個(gè)優點：

1.可用于昂貴或珍稀樣本的多(duō)次雜(zá)交；

2.有利于用不同抗體分析單次印迹上(shàng)的不同蛋白(bái)，比如不同亞型的抗體；

3.有利于對異常結果進行重新分析或确認；

4.有利于糾正孵錯(cuò)的抗體；

5.節約試劑成本，并節約時間。

各種去除液的選擇請點擊Western一(yī)抗二抗去除液選擇指南(nán)。

● 貯存：

   按照(zhào)标簽溫度貯存，有效期一(yī)年(nián)；常溫運輸。

● 用前必讀(dú)：

1. 理想的抗體去除液應該是洗脫抗體的同時，不洗脫膜上(shàng)結合的蛋白(bái)或者不改變抗原的結合性質，但是目前沒有一(yī)種去除液可以做到(dào)隻洗脫抗體，而完全不洗脫膜上(shàng)結合的抗原；也沒有一(yī)種去除液可以适用于所有不同親和度的抗原抗體複合物(wù)。去除液洗脫能(néng)力太強，抗原也容易被洗脫；太弱，則抗體殘留太高(gāo)。因此，從(cóng)免疫印迹膜上(shàng)去除抗體的方案僅能(néng)用于定性用途，因為(wèi)在每個(gè)抗體清除循環中，或多(duō)或少都将洗去少量膜上(shàng)的蛋白(bái)。

2. PVDF膜比硝酸纖維素膜（NC膜）更堅韌，因此優先推薦使用PVDF膜用于涉及抗體剝離的實驗。

3. 從(cóng)SDS-PAGE凝膠轉印完成後立即幹燥PVDF膜或NC膜，可改善蛋白(bái)質與膜的結合，特别推薦用于涉及多(duō)次抗體剝離的實驗。在第一(yī)輪抗體檢測之前，必須使用甲醇将幹燥的PVDF膜潤濕或用1×TBST将幹燥的NC膜潤濕。已經結合有抗體的膜，決不能(néng)使得膜幹燥，否則抗體分子将與膜結合緊密，很難剝離。因此，在做完一(yī)輪ECL發光(guāng)檢測實驗後，需要用清除液清除掉膜上(shàng)的抗體，推薦将膜浸泡于1×TBS（非1×TBST）中4度保存。

4. 檢測時，優先檢測低(dī)豐度抗原：先孵育條帶較弱（表達較低(dī)）的蛋白(bái)，再孵育條帶明顯（表達較高(gāo)）的蛋白(bái)，最後再孵育内參。

5. 如條件(jiàn)允許，下(xià)一(yī)輪的抗體雜(zá)交實驗選擇種屬來源不同的一(yī)抗（對應不同種屬的二抗），減少檢測的交叉反應。

6. 該清除液适用于ECL發光(guāng)檢測的膜上(shàng)抗體清除，不适合于膜上(shàng)直接顯色（DAB，BCIP/NBT等），不适合熒光(guāng)檢測。

● 使用說明：

1. 在完成Western化學發光(guāng)檢測後，NC膜或PVDF膜用适量蒸餾水(shuǐ)中震蕩漂洗5分鍾；重複漂洗2次；1×TBST漂洗一(yī)次。

2. 棄1×TBST，加入适量的Western一(yī)抗二抗去除液和1/100體積的增強劑（例如使用5 ml去除液，加50 μl 增強劑）；在搖床上(shàng)震蕩漂洗20-30分鍾（轉速70 -80 rpm）。

3. 棄去除液，加入足量蒸餾水(shuǐ)，在搖床上(shàng)漂洗2次，每次5分鍾，把去除液徹底漂洗幹淨。

  注：殘餘的去除液會(huì)影響後續抗原抗體的的結合。

4. 可選步驟：漂洗後的轉印膜孵育ECL發光(guāng)液，檢測二抗的清除效率。曝光(guāng)5分鍾，膜上(shàng)看(kàn)不到(dào)發光(guāng)條帶表明二抗清除得比較幹淨。如果膜上(shàng)能(néng)看(kàn)到(dào)條帶，重複步驟2-3。

5．繼續進行Western的後續操作（封閉-抗體孵育-發光(guāng)檢測）。

● 實驗示例：

Western一(yī)抗二抗去除液檢測效果圖

樣品：293細胞，Ball-1細胞總蛋白(bái)(TP)，胞漿蛋白(bái)(C-Pr)，核蛋白(bái)(N-Pr)

電(diàn)泳條件(jiàn)：12% SDS-PAGE（貨号:RTD6132） 200 V 1×TGS  53 min

轉膜條件(jiàn)：NC膜，1×RealBlot 恒流400 mA 35 min

封閉：無蛋白(bái)快速封閉液  RT  60 min

一(yī)抗：TBP鼠單抗 1:5000  RT 60min孵育(圖一(yī))

      GAPDH兔多(duō)抗 1:2000 RT 60 min孵育(圖三)

二抗：羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min(圖一(yī))

      羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60 min (圖三)

抗體去除：NC膜蒸餾水(shuǐ)漂洗3次，加入5 ml抗體去除液和50 μl 增強劑，常溫，搖床 30 min

ECL曝光(guāng)5分鍾（圖二），ECL曝光(guāng)2秒(miǎo)（圖一(yī)，圖三）