Western及IP細胞裂解液

● 産品包裝：

● 産品簡介：

Western及IP細胞裂解液(Cell lysis buffer for Western and IP)，是一(yī)種在非變性條件(jiàn)下(xià)裂解細胞的裂解液。本細胞裂解液裂解的細胞，可以用于PAGE，Western，免疫沉澱(immunol precipitation，IP)和免疫共沉澱(Co-IP)。裂解液的主要成分為(wèi)20 mM Tris (pH7.5)，150 mM NaCl，1% Triton X-100等，裂解後能(néng)維持原有的蛋白(bái)間相(xiàng)互作用。由于含有較高(gāo)濃度的Triton X-100等幹擾物(wù)質，不能(néng)用傳統Bradford法測定由本裂解液裂解得到(dào)樣品的蛋白(bái)濃度，可以使用BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒（貨号：RTP7102）或Bradford蛋白(bái)濃度測定試劑盒（去垢劑兼容型）（貨号：RTP7104）測定蛋白(bái)濃度。

● 保存條件(jiàn)：

-20℃保存，一(yī)年(nián)有效。

● 注意事(shì)項：

1.為(wèi)取得最佳的使用效果，盡量避免過多(duō)的反複凍融。可以适當分裝後使用。

2. 需自(zì)備PMSF或其他蛋白(bái)酶抑制劑；如進行蛋白(bái)磷酸化研究，還(hái)需要自(zì)備磷酸酶抑制劑。

3. 裂解樣品的所有步驟都需在冰上(shàng)或4℃進行。

● 使用說明：

1.  準備裂解液：

溶解裂解液，混勻；取适當量的裂解液，在使用前數分鍾内加入1/100體積的100 mM PMSF，使PMSF的最終濃度為(wèi)1 mM。如進行蛋白(bái)磷酸化研究，需要加入磷酸酶抑制劑。

2. 細胞蛋白(bái)提取：

2.1 貼壁細胞：去除培養液，加入适量1×PBS，輕柔漂洗一(yī)遍，不要擾動貼壁細胞。按照(zhào)6孔闆每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液，移液器(qì)吹打數下(xià)，使裂解液和細胞充分接觸，冰上(shàng)裂解細胞5分鍾，用細胞刮刀刮下(xià)細胞收集于1.5 ml離心管中，冰上(shàng)繼續裂解15分鍾，間歇混勻。

2.2 懸浮細胞：450 g 4℃ 離心5 min收集細胞；用适量1×PBS重懸細胞，450 g 4℃ 離心5 min收集細胞；重複漂洗細胞一(yī)次；按照(zhào)細胞沉澱體積（PCV）20 μl加入200 μl 裂解液，混勻細胞沉澱，冰浴處理15分鍾，間歇混勻。

注：2×10⁶ Jurkat細胞，其細胞沉澱體積（PCV，Packed Cell Volume）大約為(wèi)20 μl。

2.3 裂解細胞：

用玻璃勻漿器(qì)勻漿，直至充分裂解或通(tōng)過強烈渦旋震蕩使樣品裂解充分。冰浴處理15分鍾。

注：裂解混合物(wù)不建議使用超聲波破碎儀處理，因為(wèi)超聲波處理比較劇烈，容易破壞蛋白(bái)的相(xiàng)互作用導緻蛋白(bái)變性。

2.4 離心收集上(shàng)清：

充分裂解後，4℃ 16000 g離心10分鍾，取上(shàng)清，即可進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作。

3. 組織樣品蛋白(bái)提取：

3.1 手術(shù)切除的組織塊迅速置于預冷的生(shēng)理鹽水(shuǐ)中，漂洗數次，洗淨組織血迹，用濾紙(zhǐ)吸幹組織表面液體，将組織切成細小(xiǎo)的碎片。

3.2 按照(zhào)每20 mg組織加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适當添加更多(duō)的裂解液，如果需要高(gāo)濃度的蛋白(bái)樣品，可以适當減少裂解液的用量。)

3.3 用玻璃勻漿器(qì)冰浴勻漿5-10次，收集勻漿後的裂解混合物(wù)。裂解物(wù)冰浴處理15分鍾。

注：裂解混合物(wù)不建議使用超聲波破碎儀處理，因為(wèi)超聲波處理比較劇烈，容易破壞蛋白(bái)的相(xiàng)互作用導緻蛋白(bái)變性。

3.4 充分裂解後，4℃ 16000 g離心10分鍾，取上(shàng)清，即可進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作。

實驗示例：