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Western及IP細胞裂解液(無抑制劑)

Western及IP細胞裂解液(無抑制劑)

産品編号:WL0120F

産品規格:100ml

數量
價格 ¥200

WesternIP細胞裂解液(無抑制劑)

産品包裝:

産品編号

産品名稱

産品包裝

說明書

WL0120F

WesternIP細胞裂解液(無抑制劑)

100 ml

1

産品簡介:

Western及IP細胞裂解液(Cell lysis buffer for Western and IP without inhibitors),是一(yī)種在非變性條件(jiàn)下(xià)裂解細胞的裂解液。本細胞裂解液裂解能(néng)力比較溫和,可以用于PAGE,Western,免疫沉澱(immunol precipitation,IP)和免疫共沉澱(Co-IP)。裂解液的主要成分為(wèi)20 mM Tris (pH7.5),150 mM NaCl,1% Triton X-100等,裂解後能(néng)維持原有的蛋白(bái)間相(xiàng)互作用。由于含有較高(gāo)濃度的Triton X-100等幹擾物(wù)質,不能(néng)用傳統Bradford法測定由本裂解液裂解得到(dào)樣品的蛋白(bái)濃度,可以使用BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒(貨号:RTP7102)或Bradford蛋白(bái)濃度測定試劑盒(去垢劑兼容型)(貨号:RTP7104)測定蛋白(bái)濃度。使用本裂解液時,用戶可以根據具體用途自(zì)行添加特定抑制劑或者不添加抑制劑。

保存條件(jiàn):

-20℃保存,一(yī)年(nián)有效。

注意事(shì)項:

1.為(wèi)取得最佳的使用效果,盡量避免過多(duō)的反複凍融。可以适當分裝後使用。

2. 需自(zì)備PMSF或其他蛋白(bái)酶抑制劑;如進行蛋白(bái)磷酸化研究,還(hái)需要自(zì)備磷酸酶抑制劑。

3. 裂解樣品的所有步驟都需在冰上(shàng)或4℃進行。

使用說明:

1.  準備裂解液:

溶解裂解液,混勻;取适當量的裂解液,在使用前數分鍾内加入1/100體積的100 mM PMSF,使PMSF的最終濃度為(wèi)1 mM。如進行蛋白(bái)磷酸化研究,需要加入磷酸酶抑制劑。

2. 細胞蛋白(bái)提取:

2.1 貼壁細胞:去除培養液,加入适量1×PBS,輕柔漂洗一(yī)遍,不要擾動貼壁細胞。按照(zhào)6孔闆每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液,移液器(qì)吹打數下(xià),使裂解液和細胞充分接觸,冰上(shàng)裂解細胞5分鍾,用細胞刮刀刮下(xià)細胞收集于1.5 ml離心管中,冰上(shàng)繼續裂解15分鍾,間歇混勻。

培養闆規格/培養皿表面積

細胞量

裂解液推薦使用量

100 mm培養皿

1.5×107

0.5-1 ml

60 mm培養皿

5×106

0.25-0.5 ml

35 mm培養皿

2×106

0.2-0.4 ml

6孔闆

2.5×106

100-200 μl

24孔闆

5×105

100-150 μl

96孔闆

1×105

50-100 μl

2.2 懸浮細胞:450 g 4℃ 離心5 min收集細胞;用适量1×PBS重懸細胞,450 g 4℃ 離心5 min收集細胞;重複漂洗細胞一(yī)次;按照(zhào)細胞沉澱體積(PCV)20 μl加入200 μl 裂解液,混勻細胞沉澱,冰浴處理15分鍾,間歇混勻。

注:2×106 Jurkat細胞,其細胞沉澱體積(PCV,Packed Cell Volume)大約為(wèi)20 μl。

2.3 裂解細胞:

用玻璃勻漿器(qì)勻漿,直至充分裂解或通(tōng)過強烈渦旋震蕩使樣品裂解充分。冰浴處理15分鍾。

注:裂解混合物(wù)不建議使用超聲波破碎儀處理,因為(wèi)超聲波處理比較劇烈,容易破壞蛋白(bái)的相(xiàng)互作用導緻蛋白(bái)變性。

2.4 離心收集上(shàng)清:

充分裂解後,4℃ 16000 g離心10分鍾,取上(shàng)清,即可進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作。

3. 組織樣品蛋白(bái)提取:

3.1 手術(shù)切除的組織塊迅速置于預冷的生(shēng)理鹽水(shuǐ)中,漂洗數次,洗淨組織血迹,用濾紙(zhǐ)吸幹組織表面液體,将組織切成細小(xiǎo)的碎片。

3.2 按照(zhào)每20 mg組織加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适當添加更多(duō)的裂解液,如果需要高(gāo)濃度的蛋白(bái)樣品,可以适當減少裂解液的用量。)

3.3 用玻璃勻漿器(qì)冰浴勻漿5-10次,收集勻漿後的裂解混合物(wù)。裂解物(wù)冰浴處理15分鍾。

注:裂解混合物(wù)不建議使用超聲波破碎儀處理,因為(wèi)超聲波處理比較劇烈,容易破壞蛋白(bái)的相(xiàng)互作用導緻蛋白(bái)變性。

3.4 充分裂解後,4℃ 16000 g離心10分鍾,取上(shàng)清,即可進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作。


 
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