TMB顯色液(沉澱型，組化或膜HRP顯色用)

TMB Color Development Solution for IHC or Blotting

●       産品簡介：

TMB，即 3, 3′,5 ,5′-Tetramethylbenzidine，是辣根過氧化物(wù)酶（HRP）的常用底物(wù)。在辣根過氧化物(wù)酶或其他适當過氧化物(wù)酶的催化下(xià)，TMB 會(huì)産生(shēng)藍色産物(wù)。TMB 顯色液（沉澱型，組化或膜HRP顯色用，TMB Color Development Solution for IHC or Blotting）采用最新的單一(yī)溶液的 TMB 顯色技(jì)術(shù)，用于 Western 或免疫組化等 HRP的顯色檢測，簡化了操作步驟，并且使檢測結果更加穩定可靠。本顯色液具有高(gāo)靈敏性，與 HRP反應後産生(shēng)藍紫色沉澱，沉澱吸附于印迹膜上(shàng)，不會(huì)脫落，方便顯色結果的保存和觀察。

? 本試劑盒主要适用于免疫組化或原位雜(zá)交時HRP的顯色檢測，以及Western、Southern、Northern等HRP的膜顯色檢測；本顯色液也可以用于原位檢測細胞或組織内源性的過氧化物(wù)酶。由于産生(shēng)的是沉澱型藍色産物(wù)，不适用于ELISA檢測。

? 用于免疫組化檢測時，如果每個(gè)樣品的顯色液用量為(wèi)0.1ml，則可以檢測1000個(gè)樣品；對于膜的顯色檢測，如果每次使用2.5 ml顯色液，則可以檢測40次。

● 保存條件(jiàn)：

2-8℃避光(guāng)保存；一(yī)年(nián)有效。

● 使用說明：

? 如果發現TMB顯色液出現混濁或顔色變成藍色，應該停止使用。

一(yī). 免疫組化檢測：

1. 參考免疫組化的實驗步驟，在與辣根過氧化物(wù)酶标記的抗體孵育後，用适當洗滌液洗滌3-5次，每次3-5分鍾。

2. 洗滌完畢後，去除洗滌液，滴加約100微升TMB顯色液。

3. 室溫避光(guāng)孵育3-30分鍾或更長(cháng)時間(可在濕盒中顯色過夜)，直至顯色至預期深淺。

4. 去除染色液，加入重蒸水(shuǐ)孵育10分鍾以終止反應。

5. 拍照(zhào)記錄或适當封片後拍照(zhào)記錄。如果有必要，可以使用中性紅(hóng)染色液進行複染後再進行拍照(zhào)記錄或适當封片後拍照(zhào)記錄。

二. 膜的HRP顯色檢測：

1. 參考相(xiàng)應的實驗步驟，在與辣根過氧化物(wù)酶标記的抗體孵育後，用适當洗滌液洗滌3-5次，每次5分鍾左右。

2. 洗滌完畢後，去除洗滌液，

3. 滴加約适量TMB顯色液充分覆蓋膜。

4. 室溫避光(guāng)孵育3-30分鍾或更長(cháng)時間(可長(cháng)達數小(xiǎo)時)，直至顯色至預期深淺。

5. 直接拍照(zhào)記錄。

● 常見(jiàn)問題：

一(yī). 背景顯色太深。

1. 如果背景顯色太深，一(yī)方面需考慮使用适當的封閉液進行封閉，例如選購适當的封閉液或使用和一(yī)抗相(xiàng)同來源的血清(10%)進行封閉。另一(yī)方面，請選購經過适當吸附的二抗，以減小(xiǎo)二抗的非特異性吸附。

2. 可以考慮縮短顯色時間，或降低(dī)二抗濃度。另外，選擇适當強度的洗滌液，或延長(cháng)洗滌時間也會(huì)有所幫助。

二. 沒有顯色或顯色太弱。

 1. 适當提高(gāo)一(yī)抗或二抗的濃度。在離心管内用稀釋的二抗與染色液反應，檢測二抗是否可以被正常顯色。 

2. 可以考慮使用更加靈敏的放(fàng)大檢測體系，例如使用生(shēng)物(wù)素檢測體系。

3. 可以适當延長(cháng)顯色時間。

4. 如果上(shàng)述改進不能(néng)獲得預期效果，對于免疫組化或Western，可以考慮更換效果更好的一(yī)抗；對于Southern、Northern或原位雜(zá)交，則可以考慮更換探針。

實驗示例：

樣品：K562細胞,SDS裂解液(Cat:RL1060)提取總蛋白(bái)；
電(diàn)泳：4-20%RealPAGE Tris-Glycine預制膠(Cat:RTD6117-0420)
轉膜：RealBlot快速轉膜液(Cat:RT5020),0.45μmPVDF膜，400 mA 30 min
封閉：Western封閉液I（BSA）（Cat：WB1070）常溫封閉60min
一(yī)抗：Anti-PCNA抗體（鼠單抗）（Cat：APM5012） 1:5000  RT 60min；
二抗：HRP标記羊抗鼠IgG（Cat：HGM1060） 1:5000  RT 60min；
顯色：TMB顯色液(沉澱型，組化或膜HRP顯色用)（Cat：TM1026），顯色1分鍾