2×ligation solution MasterMix
2×DNA連接緩沖液
● 産品組成：
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貨号
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名稱
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規格
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RTV701
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2×ligation solution MasterMix
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150 μl
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注；按照(zhào)10μl連接體系計算(suàn)，每次使用5μl，可以使用30次。
● 保存：-20℃
● 産品簡介：
2×ligation solution MasterMix是含有T4 DNA Ligase，ligation buffer的2×MasterMix，實驗時，隻需加入片段和載體即可進行連接反應。
适用于DNA片段和載體DNA的連接以及DNA片段和Linker或Adaptor DNA的連接。
● 注意事(shì)項
1．2×ligation solution MasterMix由于含有T4 DNA ligase，使用前冰浴中徹底融化，混勻後使用。
2．為(wèi)了提高(gāo)轉化效率，轉化時建議所加入連接産物(wù)的量不要超過感受态細胞體積的10%。
● 使用方法：
一(yī) DNA片段和載體DNA的連接
1）粘性末端的連接
1．反應體系:
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10μl體系
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終濃度
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線性載體DNA
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x μl
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10-50 ng
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插入DNA片段
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y μl
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插入片段：載體=1:1-5:1*
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2×ligation solution MasterMix
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5 μl
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1×
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ddH2O
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up to 10 μl
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*：載體與插入片段的摩爾數比需要優化：一(yī)般vector:insert在1:1~1:5之間均可得到(dào)較好的結果。用以下(xià)公式計算(suàn)片段摩爾數：pmol數= DNA量(ng)/(660×片段bp數)×1000。例如：插入片段2000bp，線性載體為(wèi)3000bp，如果載體使用量為(wèi)50ng（0.025pmol），10μl連接體系中vector:insert的摩爾比是1:3，則需要2000bp pmol數為(wèi)0.075pmol，插入片段2000bp的使用量為(wèi)100ng。
2．徹底輕柔混勻後，瞬間離心，将管壁上(shàng)的溶液收集到(dào)管底。
3．反應條件(jiàn)：16℃孵育30分鍾。
4．可取5 μl連接産物(wù)熱擊轉化50 μl感受态細胞或取1-2 μl連接産物(wù)電(diàn)擊轉化50 μl感受态細胞。
注：1）若要提高(gāo)電(diàn)轉實驗效率，推薦65℃孵育10分鍾或70℃孵育5分鍾以滅活T4 DNA Ligase後，用DNA産物(wù)純化試劑盒或氯仿抽提對連接後的DNA片段進行純化後進行電(diàn)擊轉化。
2）若要提高(gāo)轉化子數目，可将連接時間延長(cháng)至1小(xiǎo)時。
2）平末端的連接
1．反應體系:
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10μl體系
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終濃度
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線性平末端載體DNA*
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x μl
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10-50 ng
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插入DNA片段
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y μl
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插入片段：載體=1:1-5:1**
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2×ligation solution MasterMix
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5 μl
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1×
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ddH2O
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up to 10 μl
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*：平滑末端的載體與 DNA 片段進行連接時，應首先将載體進行去磷酸化處理，以防止其自(zì)身環化。
**：載體與插入片段的摩爾數比需要優化：一(yī)般vector:insert在1:1~1:5之間均可得到(dào)較好的結果。用以下(xià)公式計算(suàn)片段摩爾數：pmol數= DNA量(ng)/(660×片段bp數)×1000。例如：插入片段2000bp，線性載體為(wèi)3000bp，如果載體使用量為(wèi)50ng（0.025pmol），10μl連接體系中vector:insert的摩爾比是1:3，則需要2000bp pmol數為(wèi)0.075pmol，插入片段2000bp的使用量為(wèi)100ng。
2．徹底輕柔混勻後，瞬間離心，将管壁上(shàng)的溶液收集到(dào)管底。
3．反應條件(jiàn)：16℃孵育30分鍾。
4．可取5 μl連接産物(wù)熱擊轉化50 μl感受态細胞或取1-2 μl連接産物(wù)電(diàn)擊轉化50 μl感受态細胞。
注：1）若要提高(gāo)電(diàn)轉實驗效率，推薦65℃孵育10分鍾或70℃孵育5分鍾以滅活T4 DNA Ligase後，用DNA産物(wù)純化試劑盒或氯仿抽提對連接後的DNA片段進行純化後才能(néng)進行電(diàn)擊轉化。
2）若要提高(gāo)轉化子數目，可将連接時間延長(cháng)至1小(xiǎo)時。
二 線性DNA的自(zì)身環化
1．反應體系:
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10μl體系
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終濃度
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線性載體DNA
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x μl
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10-50 ng
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2×ligation solution MasterMix
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5 μl
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1×
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ddH2O
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up to 10 μl
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2．徹底輕柔混勻後，瞬間離心，将管壁上(shàng)的溶液收集到(dào)管底。
3．反應條件(jiàn)：16℃孵育30分鍾。
4．可取5 μl連接産物(wù)熱擊轉化50 μl感受态細胞或取1-2 μl連接産物(wù)電(diàn)擊轉化50 μl感受态細胞。
注：1）若要提高(gāo)電(diàn)轉實驗效率，推薦65℃孵育10分鍾或70℃孵育5分鍾滅活T4 DNA Ligase後，用DNA産物(wù)純化試劑盒或氯仿抽提對連接後的DNA片段進行純化後才能(néng)進行電(diàn)擊轉化。
三 接頭連接
1．反應體系:
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10μl體系
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終濃度
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線性DNA
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x μl
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100-300 ng
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磷酸化接頭
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y μl
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0.5-1 μg
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2×ligation solution MasterMix
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5 μl
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1×
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ddH2O
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up to 10 μl
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2．徹底輕柔混勻後，瞬間離心，将管壁上(shàng)的溶液收集到(dào)管底。
3．反應條件(jiàn)：16℃孵育30分鍾。
4．65℃孵育10分鍾或70℃孵育5分鍾滅活T4 DNA Ligase。連接産物(wù)可以直接進行限制性内切酶酶切反應。