柱式植物(wù)葉綠體提取試劑盒  (微量樣品)      

● 産品簡介：

葉綠體（Chloroplast）是質體的一(yī)種, 是高(gāo)等植物(wù)和一(yī)些藻類所特有的能(néng)量轉換器(qì)，是光(guāng)合作用的反應場所。在高(gāo)等植物(wù)中葉綠體為(wèi)雙凸或平凸透鏡，長(cháng)徑5~10μm，短徑2~4μm，厚2~3μm。高(gāo)等植物(wù)的葉肉細胞一(yī)般含50～200個(gè)葉綠體，可占細胞質的40%，葉綠體的數目因物(wù)種細胞類型，生(shēng)态環境，生(shēng)理狀态而有所不同。葉綠體由葉綠體外被(chloroplast envelope)、類囊體(thylakoid)和基質(stroma)三部分組成，含有3種不同的膜：外膜、内膜、類囊體膜和3種彼此分開(kāi)的腔：膜間隙、基質和類囊體腔。本公司的植物(wù)葉綠體提取試劑盒采用密度梯度離心方法，可以從(cóng)多(duō)種植物(wù)中提取高(gāo)純度的葉綠體。

1. 即用型試劑盒，用戶不需要單獨配制各種溶液。

2. 不需要液氮研磨葉片，可以從(cóng)50-100 mg材料中提取葉綠體，方便使用。

3. 試劑盒可以用于葉綠體粗提，所得葉綠體含少量其他細胞器(qì)污染，可用于後續的SDS-PAGE，Western，ELISA和蛋白(bái)組分析。也可以用于葉綠體精提，所得葉綠體完整，可用于後續的光(guāng)合作用，電(diàn)子鏈和磷酸化，跨膜轉運，體外葉綠體蛋白(bái)合成，蛋白(bái)定位等研究。還(hái)可用于葉綠體膜，基質，類囊體的提取以及葉綠體DNA和葉綠體RNA純化。

4. 以每次處理0.1 g葉片計算(suàn)，本産品可使用50次提取，每次能(néng)得到(dào)20-30 μg葉綠體（葉綠素定量）。

5. 已經成功用于拟南(nán)芥，綠蘿，菠菜，大豆，莴筍，白(bái)菜，煙(yān)草(cǎo)和甜菜等植物(wù)，還(hái)可用于更多(duō)植物(wù)（可能(néng)需要優化條件(jiàn)）。

   注：本産品适合于少量葉片（50-100 mg）葉綠體的提取，大量葉片葉綠體提取（每次處理30 g葉片）請選擇RTU5001 植物(wù)葉綠體提取試劑盒。

● 貯存及運輸：

4-8℃保存；有效期一(yī)年(nián)；試劑盒常溫運輸。

● 産品組成：

● 使用說明：

注意：葉綠體對溫度高(gāo)度敏感，所以整個(gè)操作必須在冰上(shàng)或者在冷室進行，所用器(qì)皿和溶液均需要在4℃預冷。離心時一(yī)定要在4℃進行，離心力以g而不是rpm計算(suàn)。如果需要研究葉綠體的功能(néng)，提取過程還(hái)需要在昏暗(àn)的光(guāng)線條件(jiàn)下(xià)進行。

需要自(zì)備材料：

剪刀；1.5 離心管；低(dī)溫離心機(jī)。

一(yī) 葉綠體提取：

1.1 材料預處理：

實驗前1-2天将植物(wù)放(fàng)在暗(àn)室培養以減少葉綠體中澱粉顆粒的形成，否則離心時這些顆粒很容易使葉綠體破裂。葉片在實驗前需先用自(zì)來水(shuǐ)洗淨，再用蒸餾水(shuǐ)淋洗，去掉多(duō)餘水(shuǐ)分。如果葉片采集後不能(néng)立即處理，則保存時需要保持葉片濕潤，即使如此，葉片采集後的放(fàng)置時間也不能(néng)超過一(yī)天。

1.2 葉片研磨：

1.2.1 取50-100 mg新鮮采集植物(wù)樣品（葉片，軟莖等），剪成1-3 cm²大小(xiǎo)的碎片放(fàng)入離心柱内。

注：樣品質量盡量控制在100 mg以内，有利于後續充分研磨。

1.2.2 加入0.1 ml 預冷的提取緩沖液，用塑料研磨棒向下(xià)擠壓旋轉研磨樣品20-30次（大約用時1-2分鍾），至樣品無可見(jiàn)大塊組織碎片，再補加0.3 ml 提取緩沖液，用吸頭混勻。

注：塑料研磨棒可以水(shuǐ)洗後重複使用。

1.3 離心去雜(zá)質：

蓋好2 ml收集管管蓋，4℃ 2000 g（約4600 rpm）離心 5分鍾。

1.4 粗葉綠體提取：

1.4.1 棄離心柱，吸頭吸棄離心管内上(shàng)清，保留沉澱。

注：如沉澱離心後不實，可以重懸沉澱後再次離心收集沉澱。

1.4.2 沉澱中加入0.1 ml漂洗緩沖液，輕輕重懸，溶液即為(wèi)葉綠體粗提液。

注：100 mg葉片提取的粗葉綠體，溶于0.1 ml漂洗緩沖液中，葉綠體濃度約為(wèi)0.6-1 μg Chl/μl（葉綠體濃度測定見(jiàn)步驟1.6），可以将多(duō)管葉綠體溶液4℃ 4200 g 離心5分鍾，合并葉綠體沉澱，用漂洗緩沖液将葉綠體濃度調整為(wèi) 1 μg Chl/μl（1 mg Chl/ml），分裝為(wèi)50 μl每隻，-80℃貯存。

1.5 精制葉綠體提取：

1.5.1即用型梯度分離液配制：

在幹淨的1.5 ml離心管中加入0.4 ml 密度梯度分離試劑和0.6 ml漂洗緩沖液，渦旋徹底混勻。

1.5.2 将步驟1.4.2的0.1 ml葉綠體粗提液緩慢(màn)加入到(dào)即用型梯度分離液上(shàng)方。

1.5.3 4℃ 4200 g（約6600 rpm）離心10分鍾，小(xiǎo)心棄上(shàng)清，沉澱為(wèi)精制葉綠體。

1.5.4 在沉澱中加入0.5 ml 漂洗緩沖液，輕柔重懸沉澱。

1.5.5 4℃ 4200 g（約6600 rpm）離心5分鍾，棄上(shàng)清，保留沉澱。

1.5.6沉澱中加入0.1 ml漂洗緩沖液，輕輕重懸，溶液即為(wèi)精制葉綠體。

注：100 mg葉片提取的精制葉綠體，溶于0.1 ml漂洗緩沖液中，葉綠體濃度約為(wèi)0.3-0.7 μg Chl/μl（葉綠體濃度測定見(jiàn)步驟1.6），可以将多(duō)管葉綠體溶液4℃ 4200 g 離心5分鍾，合并葉綠體沉澱，用漂洗緩沖液将葉綠體濃度調整為(wèi) 1 μg Chl/μl（1 mg Chl/ml），分裝為(wèi)50 μl每隻，-80℃貯存。

1.6 葉綠素含量測定：

通(tōng)常葉綠體含量用單位葉綠素（Chl）含量來表示，即x mg Chl/ml 葉綠體懸浮液。

1.6.1 取10 μl 葉綠體懸浮液加入到(dào)990 μl 95%乙醇溶液中，混勻。

1.6.2測定OD₆₄₉和OD₆₆₅ 吸光(guāng)值，用95%乙醇做空白(bái)對照(zhào)。

1.6.3 根據以下(xià)公式計算(suàn)葉綠素：

葉綠素濃度（mg/ml）=100×（18.16×OD₆₄₉+6.63×OD₆₆₅）

100：稀釋倍數

二. 葉綠體的使用：

2.1 葉綠體功能(néng)研究：

如果用于完整葉綠體的功能(néng)或酶活性研究，初始100 mg樣品分離得到(dào)的葉綠體樣品調整葉綠體濃度為(wèi)1 μg Chl/μl，50 μl/管分裝， -80℃貯存備用。不建議長(cháng)期貯存，盡快使用。

2.2 葉綠體蛋白(bái)電(diàn)泳：

2.2.1葉綠體蛋白(bái)變性樣品處理：

2.2.1.1 取50 μl葉綠體溶液（1 μg Chl/μl）；

2.2.1.2 4℃ 4200g 離心5分鍾，棄上(shàng)清，沉澱中加入SDS-PAGE上(shàng)樣緩沖液（貨号：PL080，PL113，PL121）處理，建議調整上(shàng)樣液濃度為(wèi)0.5 μg/μl；對于多(duō)次跨膜蛋白(bái)（Multi-pass membrane protein）的變性電(diàn)泳檢測，樣品建議使用37℃處理30分鍾，不要95℃加熱5分鍾，因為(wèi)在95℃高(gāo)溫情況下(xià)，多(duō)次跨膜蛋白(bái)極易聚集形成多(duō)聚體，樣品會(huì)聚集，WB檢測會(huì)表現為(wèi)比實際蛋白(bái)大小(xiǎo)更大的分子量；

2.2.1.3 使用SDS-PAGE凝膠（貨号：RTD6132，RTD6116）電(diàn)泳，每個(gè)泳道上(shàng)樣10-40 μl（5-20 μg）。

2.2.2 葉綠體蛋白(bái)BN非變性樣品處理：

2.2.2.1取50 μl葉綠體溶液（1 μg Chl/μl）；；

2.2.2.2 4℃ 4200g 離心5分鍾，棄上(shàng)清，沉澱中加入50 μl 類囊體膜增溶緩沖液，輕柔重懸沉澱，盡量不産生(shēng)氣泡，冰浴10分鍾；

2.2.2.3 4℃ 16000 g 10分鍾，取上(shàng)清至一(yī)幹淨1.5 ml離心管中即為(wèi)增溶後葉綠體蛋白(bái)溶液（小(xiǎo)心不要吸取沉澱），此時得到(dào)的葉綠體蛋白(bái)濃度為(wèi)1 μg/μl，其中去垢劑DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM， n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）終濃度為(wèi)2%；

2.2.2.4 葉綠體蛋白(bái)溶液中加入1/10體積類囊體膜上(shàng)樣緩沖液（10×），使用BN凝膠電(diàn)泳（貨号：RTD6139，RTD6140），每個(gè)泳道上(shàng)樣5-20 μg。

2.2.3 葉綠體蛋白(bái)等電(diàn)聚焦樣品處理（2D凝膠第一(yī)維電(diàn)泳）：

建議葉綠體沉澱中使用溶解液：7 M尿素，2 M硫脲，2%CHAPS，20 mM DTT(自(zì)備，試劑盒不提供)。

三 實驗示例：

程序：取0.1克新鮮綠蘿葉片加入到(dào)離心柱内，加入0.1 ml提取緩沖液，研磨20次，再加入0.3 ml提取緩沖液（平行做6管）；4度 2000g 離心5分鍾；棄上(shàng)清，沉澱中加入0.1ml漂洗緩沖液，合并6管得到(dào)0.6 ml粗葉綠體，保留0.2ml粗葉綠體。取0.1ml粗葉綠體加到(dào)1ml即用型梯度分離液上(shàng)層（0.4 ml密度梯度分離試劑加0.6ml漂洗緩沖液），平行做4管；4度 4200g 離心10分鍾，棄上(shàng)清，沉澱中加入0.5ml漂洗液清洗一(yī)次，4度 4200g 離心5分鍾，4管精制葉綠體沉澱合并收集于0.1ml漂洗液中。用乙醇方法測定葉綠體濃度，調整粗葉綠體和精制葉綠體濃度均為(wèi)1μg Chl/μl；取50μl葉綠體溶液，離心，沉澱中加入50 μl類囊體膜增溶緩沖液，冰浴10分鍾，4度 16000g 離心10分鍾取上(shàng)清，加入1/10體積類囊體膜上(shàng)樣緩沖液（10×），此時葉綠體蛋白(bái)濃度為(wèi)1μg/μl，上(shàng)樣10 μl和20 μl。

電(diàn)泳：RTD6138-0312  3-12%BN膠，1×BN buffer+0.02%G-250，200V 15-3.5mA 50 min

更換1×無色BN buffer 200V繼續電(diàn)泳，時間共103 min，FastBlue蛋白(bái)染色液染色30分鍾。