植物(wù)葉綠體DNA提取試劑盒        

● 産品簡介：

葉綠體（Chloroplast）是質體的一(yī)種, 是高(gāo)等植物(wù)和一(yī)些藻類所特有的能(néng)量轉換器(qì)，是光(guāng)合作用的反應場所。在高(gāo)等植物(wù)中葉綠體為(wèi)雙凸或平凸透鏡，長(cháng)徑5~10μm，短徑2~4μm，厚2~3μm。高(gāo)等植物(wù)的葉肉細胞一(yī)般含50～200個(gè)葉綠體，可占細胞質的40%，葉綠體的數目因物(wù)種細胞類型，生(shēng)态環境，生(shēng)理狀态而有所不同。葉綠體由葉綠體外被(chloroplast envelope)、類囊體(thylakoid)和基質(stroma)三部分組成，含有3種不同的膜：外膜、内膜、類囊體膜和3種彼此分開(kāi)的腔：膜間隙、基質和類囊體腔。

葉綠體DNA（Chloroplast DNA，cpDNA），存在于葉綠體内，高(gāo)等植物(wù)葉綠體的DNA為(wèi)雙鏈共價閉合環狀分子，其長(cháng)度随生(shēng)物(wù)種類而不同，其大小(xiǎo)在120 kb到(dào)217 kb之間，相(xiàng)當于噬菌體基因組的大小(xiǎo)雙鏈環狀，一(yī)個(gè)葉綠體含有10~50個(gè)cpDNA。

本試劑盒是結合植物(wù)葉綠體純化試劑盒和離心柱式植物(wù)DNA提取試劑盒而推出的新産品，專門(mén)用于植物(wù)葉綠體DNA的快速提取。

1. 純度高(gāo)，不含污染和抑制劑，可以直接用于酶切、PCR、real-time PCR、 multiplex PCR、RAPD、RFLP、AFLP、Southern Blotting, microsatellite analysis等各種後續分子生(shēng)物(wù)學實驗。

2. 以每次處理30 g葉片計算(suàn)，本産品可使用8-10次提取植物(wù)葉綠體，每次能(néng)得到(dào)3-5 mg左右葉綠體。按照(zhào)每次使用0.2 ml 葉綠體溶液計算(suàn)，可以至少提取50次葉綠體DNA的純化。cpDNA 産率一(yī)般在1-2 μg/1 g葉片樣品。OD260/280一(yī)般在1.8以上(shàng)。DNA片段長(cháng)度一(yī)般在40-50 Kb左右。

3. 已經成功用于菠菜，大豆，莴筍，白(bái)菜，煙(yān)草(cǎo)和甜菜等雙子葉植物(wù)，也适用于單子葉等其他植物(wù)（可能(néng)需要優化條件(jiàn)）。

● 貯存及運輸：

4-8℃保存，至少一(yī)年(nián)有效；試劑盒常溫運輸。

● 産品組成：

● 使用說明：

一(yī) 植物(wù)葉綠體提取：

注意：葉綠體對溫度高(gāo)度敏感，所以整個(gè)操作必須在冰上(shàng)或者在冷室進行，所用器(qì)皿和溶液均需要在4℃預冷。葉綠體提取過程中離心時一(yī)定要在4℃進行，離心力以g而不是rpm計算(suàn)。如果需要研究葉綠體的功能(néng)，提取過程還(hái)需要在昏暗(àn)的光(guāng)線條件(jiàn)下(xià)進行。

需要自(zì)備材料：

剪刀；50 ml尖底或圓底離心管；15 ml尖底或圓底離心管；漏鬥；勻漿機(jī)；低(dī)溫離心機(jī)。

1.1 材料預處理：

實驗前1-2天将植物(wù)放(fàng)在暗(àn)室培養以減少葉綠體中澱粉顆粒的形成，否則離心時這些顆粒很容易使葉綠體破裂。葉片在實驗前需先用自(zì)來水(shuǐ)洗淨，再用蒸餾水(shuǐ)淋洗，去掉多(duō)餘水(shuǐ)分。如果葉片采集後不能(néng)立即處理，則保存時需要保持葉片濕潤，即使如此，葉片采集後的放(fàng)置時間也不能(néng)超過一(yī)天。

1.2  1×葉綠體提取緩沖液（即用型）配制：

注：一(yī)個(gè)30克樣品提取反應需要 150 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）。

1.3 葉片勻漿：

1.3.1 新鮮采集植物(wù)葉片，快速去除葉脈（約30克）并将葉片剪成1-3 cm²大小(xiǎo)的碎片并浸泡在150 ml的預冷的1×葉綠體提取緩沖液（即用型）中（每克葉片加5 ml）。

1.3.2 将浸泡了葉片的溶液轉移到(dào)勻漿機(jī)（貨号：RT-2243A）中，低(dī)速勻漿10秒(miǎo)，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入勻漿機(jī)底部後，再低(dī)速勻漿10秒(miǎo)，重複10秒(miǎo)勻漿3-4次至葉片破碎即可，不要過分勻漿，否則會(huì)降低(dī)完整葉綠體的得率。

1.3.3 用2層過濾紙(zhǐ)置于小(xiǎo)漏鬥上(shàng)，将勻漿液過濾收集到(dào)預冷的250 ml量筒中，一(yī)般更換三次濾紙(zhǐ)可收集約120 ml濾液，将濾液等分到(dào)4個(gè)預冷的50 ml的塑料離心管中（每個(gè)管中的濾液不要超過35 ml）。

1.4 離心去雜(zá)質：

4℃ 200 g離心5分鍾，保留上(shàng)清，沉澱為(wèi)未破裂植物(wù)組織、細胞或細胞核（下(xià)圖）；如果樣品中澱粉含量較高(gāo)，沉澱可能(néng)為(wèi)白(bái)色。

注：此步驟用低(dī)速離心去除雜(zá)質，不能(néng)省略，否則得到(dào)的葉綠體DNA中會(huì)有核基因組的污染。

1.5 收集葉綠體粗提液：

1.5.1将步驟1.4得到(dào)的上(shàng)清液平分到(dào)4個(gè)預冷的50 ml塑料離心管中；4℃ 1100 g離心15分鍾，小(xiǎo)心棄上(shàng)清，沉澱含葉綠體，呈深綠色（下(xià)圖）。

1.5.2 在沉澱中加入1.5 ml 預冷的1×葉綠體提取緩沖液（即用型），手彈離心管底部使葉綠體重懸，收集4管溶液（約6 ml），此溶液即為(wèi)葉綠體粗提産物(wù)。

1.5.3 如果對葉綠體DNA是否含細胞核DNA的要求不高(gāo)，則葉綠體粗提液可以直接用于葉綠體DNA純化（步驟2.1）。

1.6 完整葉綠體的純化：

葉綠體重懸液配制

1.6.1 單梯度分離法（适合菠菜，白(bái)菜，莴苣，拟南(nán)芥，綠蘿等）：

1.6.1.1 40%密度梯度液配制-10 ml：

在15 ml離心管中加入6 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）和4 ml密度梯度分離試劑，充分混合均勻，得40%密度梯度液，冰浴備用。

1.6.1.2将10 ml 40%密度梯度液平分到(dào)2個(gè) 15 ml離心管中，每管5 ml；将步驟1.5.2得到(dào)的葉綠體粗提液3 ml小(xiǎo)心鋪在5 ml密度梯度液之上(shàng)；另一(yī)管重複。（5 ml 40%密度梯度液用可以分離3 ml 葉綠體粗提液，其他體積以此比例換算(suàn)）。

1.6.1.3  4℃ 3200 g離心30分鍾，綠色沉澱為(wèi)完整葉綠體（下(xià)圖）。

注：如果最上(shàng)層的分離試劑不夠清亮，可以延長(cháng)離心20分鍾。

1.6.1.4 小(xiǎo)心棄上(shàng)清，保留沉澱，每管沉澱中加入1 ml 葉綠體重懸液，輕柔重懸，可以收集到(dào)2 ml完整葉綠體溶液。

1.6.1.5 此葉綠體溶液可以提取得到(dào)無細胞核DNA污染的葉綠體DNA  

（步驟2.1）。

1.6.2雙梯度分離法（适合煙(yān)草(cǎo)，甜菜，豌豆等）：

1.6.2.1 80%密度梯度重液配制-4 ml：

在15 ml離心管中加入0.8 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）和3.2 ml 密度梯度分離試劑，充分混合均勻，得80%密度梯度重液。

1.6.2.2 40%密度梯度輕液配制-8 ml：

在另一(yī)15 ml離心管加入4.8 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）和3.2 ml 密度梯度分離試劑，充分混合均勻，得40%密度梯度輕液。

1.6.2.3 取一(yī)隻15 ml離心管，加入1.86 ml 80%密度梯度重液，随後取3.74 ml 40%密度梯度輕液小(xiǎo)心鋪在80%密度梯度重液之上(shàng)，冰浴備用；然後取步驟1.5.2得到(dào)的3 ml葉綠體粗提液小(xiǎo)心鋪在密度梯度輕液之上(shàng)。另一(yī)管重複。

注：每5.6 ml 40%/80%密度梯度液可以分離3 ml 葉綠體粗提液；其他體積按照(zhào)比例調整。

1.6.2.4 4℃ 3200 g離心30分鍾，上(shàng)層綠色帶含破碎的葉綠體、線粒體和核糖體等，重液和輕液間的綠色帶為(wèi)完整葉綠體（下(xià)圖）。

注：如果最上(shàng)層的分離試劑不夠清亮，可以延長(cháng)離心20分鍾。

1.6.2.5 重懸葉綠體：

用廣口吸管小(xiǎo)心将重液和輕液之間的綠色帶（完整葉綠體）轉  移到(dào)新的15 ml離心管中，加入三倍體積預冷的葉綠體重懸液，輕柔混勻。

1.6.2.6 離心收集葉綠體：

4℃ 1750 g離心6分鍾，小(xiǎo)心将上(shàng)清倒出後，在綠色的葉綠體沉澱中加入預冷的1 ml葉綠體重懸液，手指輕彈管底使葉綠體重懸。最終可以收集到(dào)2 ml完整葉綠體溶液。

1.6.2.7此葉綠體溶液可以提取得到(dào)無細胞核DNA污染的葉綠體DNA（步驟2.1）。

1.7 葉綠體貯存：

葉綠體可在顯微鏡下(xià)檢查葉綠體完整性。葉綠體重懸液避光(guāng)-80℃保存。葉綠體必須盡快使用，否則非常容易失去活性。

1.8 葉綠素含量測定：

通(tōng)常葉綠體含量用單位葉綠素含量來表示，即x mg 葉綠素/ml 葉綠體懸浮液。

1.8.1 取10 μl 葉綠體懸浮液加入到(dào)990 μl 80%丙酮溶液中，混勻。

1.8.2 3000 g 離心5分鍾，取上(shàng)清測定OD₆₅₂ 吸光(guāng)值，用80%丙酮做空白(bái)對照(zhào)。

1.8.3 根據以下(xià)公式計算(suàn)葉綠素：

葉綠素濃度（mg/ml）=（OD₆₅₂×100）/36

100：稀釋倍數

36：extinction coefficient in ml/cm·mg

二 葉綠體DNA提取：

注：以下(xià)離心操作可以常溫下(xià)進行。

2.1 取0.2-0.4 ml葉綠體溶液，3500 g離心2分鍾，小(xiǎo)心棄上(shàng)清，沉澱為(wèi)葉綠體。

   注：可以根據提取的葉綠體濃度大體估算(suàn)提取到(dào)的cpDNA濃度。經驗值：每50 μg 葉綠體（葉綠素濃度）可以提取到(dào)1μg cpDNA。

2.2葉綠體沉澱中加入400 μl 緩沖液AP1和6 μl RNaseA (10mg/ml)，漩渦震蕩1分鍾。

2.3 将離心管放(fàng)在65℃水(shuǐ)浴10分鍾，水(shuǐ)浴過程中颠倒離心管以混合樣品數次。

2.4 加入130 μl 緩沖液AP2，颠倒混勻，冰浴5分鍾。

2.5 12,000 rpm離心5分鍾，保留上(shàng)清，上(shàng)清通(tōng)常為(wèi)無色，沉澱為(wèi)綠色。注：此步驟離心去除去垢劑，蛋白(bái)以及多(duō)糖等雜(zá)質。

2.6 将上(shàng)清（通(tōng)常可取到(dào)400 μl）轉移到(dào)1.5 ml離心管中，加入1.5倍體積（例如400 μl的上(shàng)清液加600 μl）緩沖液AP3（使用前請注意是否已經加入無水(shuǐ)乙醇），立即颠倒混勻，簡短離心以去除管蓋内壁的水(shuǐ)珠。

2.7吸取步驟2.6中的混合液加入到(dào)吸附柱CG中（吸附柱放(fàng)入收集管中），12,000 rpm離心1分鍾，倒掉廢液，吸附柱CG放(fàng)回收集管中。

注：離心吸附柱的最大容積是700 μl，如果一(yī)次不能(néng)完全上(shàng)柱，可以分次上(shàng)柱離心，保證全部溶液全部加到(dào)離心柱中。

2.8向吸附柱CG中加入700 μl漂洗液PW（使用前請先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇），12,000 rpm離心1分鍾，倒掉廢液，吸附柱CG放(fàng)入收集管中。

2.9向吸附柱CG中加入500 μl漂洗液PW（使用前請先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇），12,000 rpm離心1分鍾，倒掉廢液，吸附柱CG放(fàng)入收集管中。

2.10将吸附柱CG放(fàng)回廢液收集管中，12,000 rpm離心2分鍾。

注：此步驟非常重要，目的是将吸附柱中殘餘的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響後續的酶反應（酶切、PCR等）實驗。

2.11将吸附柱CG轉入一(yī)個(gè)幹淨的1.5ml離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-100 μl經65℃水(shuǐ)浴預熱的洗脫緩沖液EB，室溫放(fàng)置2分鍾，12,000 rpm g離心2分鍾。

注：洗脫緩沖液體積不要少于50 μl，體積過小(xiǎo)影響回收效率；洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水(shuǐ)做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5範圍内，pH值低(dī)于7.0會(huì)降低(dī)洗脫效率。

2.12  葉綠體DNA産物(wù)-20℃保存。

三 實驗示例：

3.1 葉綠體提取示例：

30克綠蘿葉片，加入150 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）  勻漿5×10秒(miǎo)，3次過濾共收集120 ml過濾液，平分4管，4℃ 1100 g 離心15 min，棄上(shàng)清，每管重懸于1.5 ml 1×葉綠體提取緩沖液（即用型）中，共得到(dào)6 ml 葉綠體粗提液。2×3 ml 粗提液平鋪于2×5 ml 40%密度梯度液之上(shàng)，4℃ 3200 g離心15分鍾，棄上(shàng)清，每管沉澱重懸于1 ml 葉綠體重懸液中，共得到(dào)2 ml精制葉綠體重懸液，測定葉綠素含量為(wèi)3.43 mg/ml重懸液。30克葉片提取得到(dào)6.86 mg葉綠體。取10 μl葉綠體溶液稀釋20倍，取50 μl稀釋液顯微鏡40倍物(wù)鏡觀察，如下(xià)圖。

3.2 葉綠體DNA電(diàn)泳示例：

葉綠體提取同3.1。取100 μl葉綠體重懸液，提取cpDNA，最後用50 μl洗脫，上(shàng)樣5 μl，電(diàn)泳結果見(jiàn)下(xià)圖左二泳道，cpDAN大小(xiǎo)約20kb，無可見(jiàn)核基因組污染。