植物(wù)原生(shēng)質體轉化試劑盒
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貨号
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名稱
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包裝
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RTU4092
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植物(wù)原生(shēng)質體轉化試劑盒
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40次
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● 産品組成：
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序号
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組分貨号
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名稱
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規格
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貯存
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運輸
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1
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RTU4092-01
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轉化終止溶液
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50
ml
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-20℃
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RT
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2
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RTU4092-02
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轉化試劑
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5
ml
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-20℃
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RT
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3
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RTU4092-03
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培養溶液
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50
ml
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-20℃
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RT
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4
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說明書
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一(yī)份
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● 産品簡介：
植物(wù)原生(shēng)質體是指脫去全部細胞壁由質膜包被的具有生(shēng)命活力的裸露細胞。它具有細胞生(shēng)命特征和全能(néng)型，是細胞無性系變異和突變體篩選的重要來源，同時也是植物(wù)遺傳工(gōng)程的理想受體和遺傳改良的理想材料。植物(wù)原生(shēng)質體轉化試劑盒(Plant Protoplasts Transformation Kit)采用的是聚乙二醇轉化方法，借助聚乙二醇短時間内對原生(shēng)質體産生(shēng)的沖擊效應，使質粒DNA、RNA或蛋白(bái)得以進入原生(shēng)質體，經轉化的植物(wù)原生(shēng)質體經過一(yī)定時間培養後，可用于檢測外源基因的表達和功能(néng)，轉化後基因敲除或基因編輯效果等。
對于拟南(nán)芥原生(shēng)質體，使用本試劑盒轉化質粒後通(tōng)常2-6小(xiǎo)時可以檢測相(xiàng)關基因的轉錄變化(mRNA等RNA的變化)，通(tōng)常2-16小(xiǎo)時後可以檢測到(dào)相(xiàng)關蛋白(bái)表達的變化，通(tōng)常24小(xiǎo)時可以檢測到(dào)基因編輯的效果。
本試劑盒可以用于相(xiàng)當于6孔闆40個(gè)孔的樣品，12孔闆20個(gè)孔的樣品，或24孔闆40個(gè)孔的樣品的轉化。
本試劑盒不含有原生(shēng)質體制備試劑，需要制備原生(shēng)質體請參見(jiàn)植物(wù)原生(shēng)質體制備試劑盒（RTU4082 ）。
● 貯存和效期：
按照(zhào)溫度貯存，有效期一(yī)年(nián)。轉化試劑現用現配。
試劑盒常溫運輸。
● 使用說明：
需要準備的材料（試劑盒不提供）：
平頭鑷子；一(yī)次性刀片；50ml離心管；1.5ml離心管；水(shuǐ)浴鍋
一(yī)、原生(shēng)質體轉化步驟：
1. 轉化溶液配制：
植物(wù)原生(shēng)質體轉化參考下(xià)表根據樣品量配制轉化溶液。
轉化溶液現用現配。轉化溶液需要在轉化前至少1小(xiǎo)時配制，以确保轉化試劑溶解充分。轉化溶液配制後盡量當天使用。配制好的轉化溶液4℃保存3-5天之内仍然有較好的轉化效率，但和當天配制的轉化溶液相(xiàng)比，轉化效果可能(néng)會(huì)有一(yī)定程度的下(xià)降。
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120 μl
（1個(gè)樣品）
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1.2 ml
（10個(gè)樣品）
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5 ml
(約40個(gè)樣品)
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轉化試劑粉末
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48
mg
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480
mg
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2
g
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轉化試劑溶解液（2×）
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60
μl
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0.6
ml
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2.5
ml
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滅菌水(shuǐ)
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定容至120 μl
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定容至1.2 ml
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定容至5 ml
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2. 準備質粒：
取10 μl質粒DNA(10-20
μg，濃度為(wèi)1-2 μg/μl)于1.5 ml 離心管中。
注：質粒大小(xiǎo)建議為(wèi)5-10
kb，質粒濃度為(wèi)1-2 μg/μl左右；原生(shēng)質體轉化對于質粒的純度要求較高(gāo)，盡量使用高(gāo)純度的質粒。多(duō)個(gè)質粒同時轉化時的體積和總質量保持不變。多(duō)個(gè)質粒轉化時，每種質粒的用量比例，需要酌情自(zì)行調整。質粒轉化也可以在12或24孔闆中進行，轉化體系也可以按照(zhào)比例放(fàng)大或縮小(xiǎo)。本試劑盒中描述的用量相(xiàng)當于是6孔闆中的用量。原生(shēng)質體用多(duō)孔闆培養時，最好選擇未經表面處理的多(duō)孔闆。對于經過表面處理的動物(wù)細胞培養用多(duō)孔闆，可以使用5%胎牛血清或小(xiǎo)牛血清處理孔表面數秒(miǎo)，這樣有助于減小(xiǎo)孔底表面對于原生(shēng)質體的損傷。
3. 質粒轉化：
3.1 質粒管中加入100 μl原生(shēng)質體溶液（原生(shēng)質體密度為(wèi)2×105/ml，約2萬個(gè)原生(shēng)質體），輕柔混勻。
3.2 加入等體積即110 μl 步驟1事(shì)先準備好的轉化溶液，輕彈管底，輕柔混勻，常溫25℃放(fàng)置5-15分鍾。
注：最長(cháng)可以孵育15 min，但通(tōng)常孵育5min時間已經足夠。最佳的孵育時間對于不同的原生(shēng)質體和不同的質粒需要通(tōng)過實驗摸索。
4. 終止轉化：
加入2倍體積轉化終止溶液即440 μl，輕柔徹底混勻，終止轉化過程。
5. 收集原生(shēng)質體：
常溫100g離心1-2分鍾，盡量去除上(shàng)清。
注：由于轉化後的溶液會(huì)非常粘稠，加入轉化終止溶液後離心1 min通(tōng)常可以使原生(shēng)質體聚集在管底，但使用某些突變體時為(wèi)減少原生(shēng)質體損失，可将離心時間延長(cháng)到(dào)2 min。為(wèi)了避免原生(shēng)質體離心時貼在管壁，建議整個(gè)實驗過程使用水(shuǐ)平轉頭；離心時，可調低(dī)離心機(jī)的升速和降速。升速過快，原生(shēng)質體可能(néng)離到(dào)管壁上(shàng)；降速過快，可能(néng)導緻管底原生(shēng)質體懸起。建議升速和降速分别都使用3。
6. 原生(shēng)質體漂洗：
加入500 μl 轉化終止溶液輕輕重懸原生(shēng)質體，常溫100g離心1 min，盡量去除殘留的上(shàng)清。
注：本步驟可以充分去除殘留的轉化試劑溶液中的組分，避免轉化試劑溶液中的組分對于後續的不良影響。
7. 原生(shēng)質體重懸：
沉澱中加入1
ml培養溶液，輕柔重懸。
8. 原生(shēng)質體培養：
将離心管水(shuǐ)平放(fàng)置，23-25oC弱光(guāng)培養。
注：根據實驗需求确定孵育時間。RNA分析孵育2-6小(xiǎo)時；酶活性分析和蛋白(bái)标記實驗孵育2-16小(xiǎo)時；基因編輯的效果在轉化24小(xiǎo)時後可能(néng)被檢測到(dào)。
使用植物(wù)原生(shēng)質體轉化試劑盒轉化拟南(nán)芥原生(shēng)質體的效果圖。
實驗步驟：稱取0.48
g轉化試劑于2 ml 離心管中，加入轉化試劑溶解液後，颠倒混勻，蒸餾水(shuǐ)定容至2 ml，使轉化試劑充分溶解後備用。在2 ml的圓底離心管中加入10 μl（20 μg）EGFP質粒
(植物(wù)用綠色熒光(guāng)蛋白(bái))，加入100 μl制備好的原生(shēng)質體，輕柔混勻後加入110 μl當日配制好的轉化試劑溶液，輕柔混勻，常溫靜(jìng)置5
min後加入440 μl轉化終止溶液終止轉化，輕輕颠倒混勻，常溫100 g離心1
min，去除上(shàng)清，再加入0.5 ml 轉化終止溶液，輕柔重懸原生(shēng)質體，常溫100
g離心1 min後，盡量去除上(shàng)清，收集原生(shēng)質體。加入1 ml培養溶液，小(xiǎo)心重懸原生(shēng)質體後水(shuǐ)平放(fàng)置25℃培養過夜(約16h)，次日于熒光(guāng)顯微鏡下(xià)檢測EGFP熒光(guāng)信号。
植物(wù)原生(shēng)質體提取試劑盒發表文章列表
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實驗植物(wù)：小(xiǎo)麥
Author: Xu Feng, Yongqing Xu, Lina
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Paper link：http://www.plantphysiol.org/content/174/4/2487
2. [IF=5.36] Involvement of the
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實驗植物(wù)：煙(yān)草(cǎo)
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Ying Chen, Yanzhen Tian, Liangliang Jiang, Jiejun Peng, Hongying Zheng,
Lin Lin, Chengqi Yan, Michael Taliansky, Stuart MacFarlane, Yuanhua Wu,
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Paper link：https://academic.oup.com/jxb/article/71/6/2142/5686178?login=true
3. [IF=7.228] Turnip mosaic
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實驗植物(wù)：煙(yān)草(cǎo)
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實驗植物(wù)：水(shuǐ)稻
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Paper link：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2021.684923/full
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Paper link：https://www.techscience.com/phyton/v91n3/45309
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Hu
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Paper link： https://link.springer.com/article/10.1007/s10811-022-02718-x
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Journal: Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 4901.
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9. [2021 IF=17.9] Genome-wide association
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Xiaoyang Ge, Yuan Yuan, Yuying Jin, Ye Wang, Lihong Zhao, Xiao Han, Wei Hu, Lan
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Journal: Genome Biology (2023) 24:111
Institution：Institute
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Paper link： https://doi.org/10.1186/s13059-023-02950-9
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Jinyi ,Wang Changquan
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Institution：College of Horticulture, Nanjing
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