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植物(wù)原生(shēng)質體制備試劑盒

植物(wù)原生(shēng)質體制備試劑盒

産品編号：RTU4082

産品規格：20次

數量
價格 ￥700
說明書下(xià)載

植物(wù)原生(shēng)質體制備試劑盒                                        

 

貨号

名稱

包裝

RTU4082

植物(wù)原生(shēng)質體制備試劑盒

5 ml×20次

 

●  産品組成：

序号

組分貨号

名稱

規格

貯存

運輸

1

RTU4082-01

溶液I-酶溶解溶液（2×）

50 ml

-20℃

RT

2

RTU4082-02

溶液II-漂洗溶液（5×）

50 ml

-20℃

RT

3

RTU4082-03

溶液III-重懸溶液

25 ml

-20℃

RT

4

BME

還(hái)原劑

1 ml

RT

RT

5

BSA-02

50mg/ml BSA溶液

5 ml

-20℃

RT

6

CYL0014

Enzyme Premix酶混合物(wù)

2 g

-20℃

RT

7

RT-1070

70 μm細胞過濾器(qì)

5個(gè)/包

RT

RT

 

 

說明書

一(yī)份

 

 

● 産品簡介：

植物(wù)原生(shēng)質體是指脫去全部細胞壁由質膜包被的具有生(shēng)命活力的裸露細胞。它具有細胞生(shēng)命特征和全能(néng)型，是細胞無性系變異和突變體篩選的重要來源，同時也是植物(wù)遺傳工(gōng)程的理想受體和遺傳改良的理想材料。酶解法分離原生(shēng)質體是一(yī)個(gè)常用的技(jì)術(shù)，其原理是植物(wù)細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶、離析酶和果膠酶能(néng)降解細胞壁成分，去除細胞壁，即可得到(dào)原生(shēng)質體。試劑盒配套的酶混合物(wù)是纖維素酶R-10和離析酶R-10的混合物(wù)，優化的酶配比能(néng)很好地消化植物(wù)細胞壁，提取到(dào)良好的植物(wù)原生(shēng)質體。

按照(zhào)每次使用5 ml酶消化體系計算(suàn)，本試劑盒可用于20次酶消化反應。本試劑盒每個(gè)5 ml反應體系可處理0.1 g左右的拟南(nán)芥葉片(約10~15葉片)，操作較好的情況下(xià)每5 ml體系可獲得約50-70萬個(gè)原生(shēng)質體(不同植物(wù)不同操作會(huì)有一(yī)定的差異)，可滿足約25-70個(gè)樣品的原生(shēng)質體質粒轉染操作(按照(zhào)每樣1-2萬個(gè)細胞計算(suàn))。

本試劑盒不含有原生(shēng)質體轉化試劑，需要轉化請參見(jiàn)植物(wù)原生(shēng)質體轉化試劑盒（RTU4092 ）。

● 貯存、效期及運輸：

  按照(zhào)标簽溫度保存，至少一(yī)年(nián)有效。-20℃貯存組分4℃存放(fàng)3-4不會(huì)影響使用效果。3-4天經常使用的情況，可以全部保存在4℃。

試劑盒常溫運輸。

● 使用說明：

   需要準備的材料（試劑盒不提供）：

   平頭鑷子；一(yī)次性刀片；50 ml離心管；1.5 ml離心管；水(shuǐ)浴鍋

一(yī)、原生(shēng)質體分離：

即用型酶溶液配制

 

5 ml配制量

溶液I（2×）

2.5 ml

酶混合物(wù)

0.095克

55℃處理10分鍾，間歇混勻，冷卻到(dào)常溫後加入以下(xià)試劑

還(hái)原劑

2.5 μl

50mg/ml BSA

0.1 ml

滅菌水(shuǐ)

定容至5 ml

注：溶液I容易被微生(shēng)物(wù)污染，使用時須嚴格按照(zhào)無菌操作規範進行或者适當分裝後使用。

55℃處理能(néng)滅活核酸酶和蛋白(bái)酶并促進酶的溶解；

即用型酶溶液現用現配，不建議配制後凍存後再使用；

溶解好的正常酶溶液應為(wèi)澄清棕黃色溶液，如使用純度不好的酶，溶液為(wèi)不溶解的乳白(bái)色懸濁液，不能(néng)使用。

1. 酶解：

取生(shēng)長(cháng)狀态良好的葉片切成0.5-1 mm的小(xiǎo)條，按照(zhào)0.1 克葉片（拟南(nán)芥約15-20個(gè)葉片）加5 ml即用型酶溶液的比例迅速将切割好的葉片小(xiǎo)條浸泡于酶溶液中，避光(guāng)，無需震蕩，常溫（20-25℃）酶解3小(xiǎo)時，間歇混勻。

注：酶解時間與葉片種類，葉片生(shēng)長(cháng)狀态有關，請根據實驗需要适當調整酶解時間。3小(xiǎo)時為(wèi)拟南(nán)芥葉片推薦的酶解時間。如條件(jiàn)允許，可以使用微型真空泵常溫避光(guāng)條件(jiàn)下(xià)抽真空30 min，以使酶溶液更好地進入細胞間隙。酶溶液變為(wèi)綠色表明有原生(shēng)質體已經有分離，溶液為(wèi)濃綠色表明原生(shēng)質體已經大量分離。拟南(nán)芥原生(shēng)質體大小(xiǎo)約為(wèi)30-50 μm，顯微鏡鏡檢後确定是否分離。葉片原生(shēng)質體細胞顯微鏡下(xià)為(wèi)綠色圓球狀，葉綠體分散在整個(gè)細胞内，說明狀态較好；如呈現不規則形狀，說明原生(shēng)質

體破碎或即将破碎。


  

 2. 漂洗：

        取适量溶液II-漂洗溶液（5×），用超純水(shuǐ)稀釋為(wèi)1×漂洗溶液。

 

1×漂洗溶液

組份

50 ml配制量

溶液II-漂洗溶液（5×）

10 ml

滅菌水(shuǐ)

40 ml

酶解後加入等體積的1×漂洗溶液，如使用5 ml酶解體系，加入5 ml 1×漂洗溶液，輕柔混勻。

3. 過濾：

用孔徑70 μm篩網過濾步驟2中的溶液，去除未消化的葉片，用5-10 ml 1×漂洗溶液沖洗酶解器(qì)皿和未消化的葉片1-2次，将所有的液體收到(dào)50 ml離心管中。

4. 第一(yī)次收集：

濾出液100g常溫離心 2分鍾，盡量去除上(shàng)清。

注：為(wèi)了避免原生(shēng)質體離心時貼在管壁，建議整個(gè)實驗過程使用水(shuǐ)平轉頭；離心時，可調低(dī)離心機(jī)的升速和降速。升速過快，原生(shēng)質體可能(néng)離到(dào)管壁上(shàng)；降速過快，可能(néng)導緻管底原生(shēng)質體懸起。建議升速和降速分别都使用3。

5. 第二次收集：

加入2-5 ml 1×漂洗溶液，用剪尖的藍吸頭重懸原生(shēng)質體，冰浴30分鍾，原生(shēng)質體在重力

作用下(xià)可以沉降到(dào)離心管底部，盡量吸除上(shàng)清，收集原生(shēng)質體。(如果發現原生(shēng)質體沉降的速度比較慢(màn)或者得率比較低(dī)，也可以考慮常溫100 g離心1-2 min收集原生(shēng)質體)。

6. 重懸：

小(xiǎo)心去除上(shàng)清溶液，不要觸動原生(shēng)質體沉澱，沉澱用剪尖的藍吸頭重懸于1 ml溶液III中即為(wèi)原生(shēng)質體溶液。（可以用血球計數闆計數，根據原生(shēng)質體數量調整溶液III的加入體積，使得原生(shēng)質體密度為(wèi)2×105/ml或更高(gāo)）。

注：制備好的原生(shēng)質體可以在4oC或冰浴保存至少24 h。

二、實驗示例：


                使用植物(wù)原生(shēng)質體制備試劑盒轉染拟南(nán)芥原生(shēng)質體的效果圖。

實驗步驟：稱取0.48 g轉化試劑于2 ml 離心管中，加入轉化試劑溶解液後，颠倒混勻，蒸餾水(shuǐ)定容至2 ml，使轉化試劑充分溶解後備用。在2 ml的圓底離心管中加入10 μl（20 μg）EGFP質粒 (植物(wù)用綠色熒光(guāng)蛋白(bái))，加入100 μl制備好的原生(shēng)質體，輕柔混勻後加入110 μl當日配制好的轉化試劑溶液，輕柔混勻，常溫靜(jìng)置5 min後加入440 μl 1×漂洗溶液終止轉化，輕輕颠倒混勻，常溫100 g離心1 min，去除上(shàng)清，再加入0.5 ml 1×漂洗溶液，輕柔重懸原生(shēng)質體，常溫100 g離心1 min後，盡量去除上(shàng)清，收集原生(shēng)質體。加入1 ml溶液V，小(xiǎo)心重懸原生(shēng)質體後水(shuǐ)平放(fàng)置25℃培養過夜(約16h)，次日于熒光(guāng)顯微鏡下(xià)檢測EGFP熒光(guāng)信号。


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