植物(wù)原生(shēng)質體制備及轉化試劑盒plus
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貨号
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名稱
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包裝
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RTU4072
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植物(wù)原生(shēng)質體制備及轉化試劑盒plus
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5 ml×40次
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● 産品組成：
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序号
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組分貨号
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名稱
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規格
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貯存
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運輸
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1
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RTU4052-01
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溶液I（2×）-酶溶解溶液
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100
ml
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-20℃
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RT
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2
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RTU4052-02
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溶液II-漂洗溶液
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200
ml
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-20℃
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RT
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3
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RTU4052-03
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溶液III-重懸溶液
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25
ml
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-20℃
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RT
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4
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RTU4052-04
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溶液IV-轉化溶液
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5
ml
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-20℃
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RT
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5
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RTU4052-05
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溶液V-培養溶液
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25
ml
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-20℃
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RT
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6
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BME
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還(hái)原劑
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1
ml
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RT
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RT
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7
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BSA-02
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50mg/ml
BSA溶液
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5
ml
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-20℃
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RT
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8
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CYL0012-01
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纖維素酶R-10
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3
g
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-20℃
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RT
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9
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MYL0021
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離析酶R-10
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1
g
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-20℃
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RT
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10
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RT-1070
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70
μm細胞過濾器(qì)
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5個(gè)/包
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RT
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RT
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說明書
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一(yī)份
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● 産品簡介：
植物(wù)原生(shēng)質體是指脫去全部細胞壁由質膜包被的具有生(shēng)命活力的裸露細胞。它具有細胞生(shēng)命特征和全能(néng)型，是細胞無性系變異和突變體篩選的重要來源，同時也是植物(wù)遺傳工(gōng)程的理想受體和遺傳改良的理想材料。酶解法分離原生(shēng)質體是一(yī)個(gè)常用的技(jì)術(shù)，其原理是植物(wù)細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶、離析酶和果膠酶能(néng)降解細胞壁成分，去除細胞壁，即可得到(dào)原生(shēng)質體。許多(duō)方法可誘導原生(shēng)質體融合，現在被廣泛采用的融合方法是聚乙二醇（PEG）法。聚乙二醇（PEG）作為(wèi)一(yī)種高(gāo)分子化合物(wù)，合适的濃度能(néng)對原生(shēng)質體産生(shēng)瞬間沖擊效應，原生(shēng)質體很快發生(shēng)收縮與粘連，随後用高(gāo)鈣高(gāo)pH法進行清洗，使原生(shēng)質體融合得以完成。
按照(zhào)每次使用5
ml酶消化體系計算(suàn)，本試劑盒可用于40次酶消化反應。本試劑盒每個(gè)5 ml反應體系可處理0.1 g左右的拟南(nán)芥葉片(約10~15葉片)，操作較好的情況下(xià)每5 ml體系可獲得約50-70萬個(gè)原生(shēng)質體(不同植物(wù)不同操作會(huì)有一(yī)定的差異)，可滿足約25-70個(gè)樣品的原生(shēng)質體質粒轉染操作(按照(zhào)每個(gè)樣品1-2萬個(gè)細胞計算(suàn))。
原生(shēng)質體轉化時，本試劑盒可以用于相(xiàng)當于6孔闆40個(gè)孔的樣品，12孔闆80個(gè)孔的樣品，或24孔闆160個(gè)孔的樣品的轉化。
● 貯存和效期：
-20oC保存，至少一(yī)年(nián)有效。
組分I，II，III，V 4℃存放(fàng)3-5天不會(huì)影響使用效果，長(cháng)期不用，按照(zhào)标簽℃貯存。
試劑盒常溫運輸。
● 使用說明：
需要準備的材料（試劑盒不提供）：
剪尖吸頭（剪尖後可以用酒精燈過火将吸頭處理平滑）；平頭鑷子；70 μm細胞過濾篩；一(yī)次性刀片；50 ml離心管；1.5 ml離心管；水(shuǐ)浴鍋。
一(yī)、原生(shēng)質體分離：
即用型酶溶液配制
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5 ml配制量
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10 ml 配制量
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溶液I（2×）
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2.5
ml
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5
ml
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纖維素酶R-10
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0.075克
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0.15 克
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離析酶R-10
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0.02 克
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0.04 克
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混勻後 55℃水(shuǐ)浴 10 min，期間颠倒混勻 2-3次，冷卻至常溫後加入以下(xià)成分。
注：55oC孵育可以有效滅活DNase和Protease，并促進酶溶解
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還(hái)原劑
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2.5
μl
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5
μl
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50mg/ml
BSA
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0.1
ml
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0.2
ml
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滅菌水(shuǐ)
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定容至5 ml
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定容至10 ml
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注：即用型酶溶液現用現配，不建議配制後凍存後再使用；
溶解好的正常酶溶液應為(wèi)澄清棕黃色溶液，如使用純度不好的酶，溶液為(wèi)不溶解的乳白(bái)色懸濁液，不能(néng)使用。
1. 酶解：
取生(shēng)長(cháng)狀态良好的葉片切成0.5-1 mm的小(xiǎo)條，按照(zhào)0.1
克葉片（拟南(nán)芥約15-20個(gè)葉片）加5 ml即用型酶溶液的比例迅速将切割好的葉片小(xiǎo)條浸泡于酶溶液中，避光(guāng)，無需震蕩，常溫（20-25℃）酶解3小(xiǎo)時，間歇混勻。
注：酶解時間與葉片種類，葉片生(shēng)長(cháng)狀态有關，請根據實驗需要适當調整酶解時間。3小(xiǎo)時為(wèi)拟南(nán)芥葉片推薦的酶解時間。如條件(jiàn)允許，可以使用微型真空泵常溫避光(guāng)條件(jiàn)下(xià)抽真空30 min，以使酶溶液更好地進入細胞間隙。酶溶液變為(wèi)綠色表明有原生(shēng)質體已經有分離，溶液為(wèi)濃綠色表明原生(shēng)質體已經大量分離。拟南(nán)芥原生(shēng)質體大小(xiǎo)約為(wèi)30-50 μm，顯微鏡鏡檢後确定是否分離。葉片原生(shēng)質體細胞顯微鏡下(xià)為(wèi)綠色圓球狀，葉綠體分散在整個(gè)細胞内，說明狀态較好；如呈現不規則形狀，說明原生(shēng)質
體破碎或即将破碎。
2. 漂洗：
酶解後加入等體積的溶液II，如使用5 ml酶解體系，加入5 ml溶液II，輕柔混勻。
3. 過濾：
用孔徑70 μm篩網過濾步驟2中的溶液，去除未消化的葉片，收集濾出液于50 ml離心管中。
4. 第一(yī)次收集：
濾出液100g常溫離心 2分鍾，盡量去除上(shàng)清。
注：為(wèi)了避免原生(shēng)質體離心時貼在管壁，建議整個(gè)實驗過程使用水(shuǐ)平轉頭；離心時，可調低(dī)離心機(jī)的升速和降速。升速過快，原生(shēng)質體可能(néng)離到(dào)管壁上(shàng)；降速過快，可能(néng)導緻管底原生(shēng)質體懸起。
5. 第二次收集：
加入2-5 ml 溶液II，用剪尖的藍吸頭重懸原生(shēng)質體，冰浴30分鍾，原生(shēng)質體在重力作用下(xià)可以沉降到(dào)離心管底部，盡量吸除上(shàng)清，收集原生(shēng)質體。(如果發現原生(shēng)質體沉降的速度比較慢(màn)或者得率比較低(dī)，也可以考慮常溫100 g離心1-2 min收集原生(shēng)質體)。
6. 重懸：
小(xiǎo)心去除上(shàng)清溶液，不要觸動原生(shēng)質體沉澱，沉澱用剪尖的藍吸頭重懸于1 ml溶液III中即為(wèi)原生(shēng)質體溶液。（可以用血球計數闆計數，根據原生(shēng)質體數量調整溶液III的加入體積，使得原生(shēng)質體密度為(wèi)2×105/ml或更高(gāo)）。
注：制備好的原生(shēng)質體可以在4oC或冰浴保存至少24 h。
二、原生(shēng)質體轉化和培養：
1. 轉化溶液配制：
植物(wù)原生(shēng)質體轉化參考下(xià)表根據樣品量配制轉化溶液。
轉化溶液現用現配。轉化溶液需要在轉化前至少1小(xiǎo)時配制，以确保轉化試劑溶解充分。轉化溶液配制後盡量當天使用。配制好的轉化溶液4℃保存3-5天之内仍然有較好的轉化效率，但和當天配制的轉化溶液相(xiàng)比，轉化效果可能(néng)會(huì)有一(yī)定程度的下(xià)降。
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120 μl
（1個(gè)樣品）
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1.2 ml
（10個(gè)樣品）
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5 ml
(約40個(gè)樣品)
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轉化試劑粉末
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48
mg
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480
mg
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2
g
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轉化試劑溶解液（2×）
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60
μl
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0.6
ml
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2.5
ml
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滅菌水(shuǐ)
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定容至120 μl
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定容至1.2 ml
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定容至5 ml
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2. 準備質粒：
取10 μl質粒DNA(10-20
μg，濃度為(wèi)1-2 μg/μl)于1.5 ml 離心管中。
注：質粒大小(xiǎo)建議為(wèi)5-10
kb，質粒濃度為(wèi)1-2 μg/μl左右；
原生(shēng)質體轉化對于質粒的純度要求較高(gāo)，盡量使用高(gāo)純度的質粒。
3. 質粒轉化：
3.1 質粒管中加入100 μl原生(shēng)質體溶液（原生(shēng)質體密度為(wèi)2×105/ml，約2萬個(gè)原生(shēng)質體），輕柔混勻。
3.2 加入等體積即110 μl 步驟1事(shì)先準備好的轉化溶液，輕彈管底，輕柔混勻，常溫25℃放(fàng)置5-15分鍾。
注：最長(cháng)可以孵育15 min，但通(tōng)常孵育5min時間已經足夠。最佳的孵育時間對于不同的原生(shēng)質體和不同的質粒需要通(tōng)過實驗摸索。
4. 終止轉化：
加入2倍體積即440 μl 溶液II，輕柔徹底混勻，終止轉化過程。
5. 收集原生(shēng)質體：
常溫100g離心1-2分鍾，盡量去除上(shàng)清。
注：由于轉化後的溶液會(huì)非常粘稠，加入溶液II後離心1
min通(tōng)常可以使原生(shēng)質體聚集在管底，但使用某些突變體時為(wèi)減少原生(shēng)質體損失，可将離心時間延長(cháng)到(dào)2 min。
6. 原生(shēng)質體漂洗：
加入500 μl溶液II用剪尖藍吸頭輕輕重懸原生(shēng)質體，常溫100g離心1 min，盡量去除殘留的上(shàng)清。
注：本步驟可以充分去除殘留的轉染試劑溶液中的組分，避免轉染試劑溶液中的組分對于後續的不良影響。
7. 原生(shēng)質體重懸：
沉澱中加入1
ml溶液V，用剪尖藍吸頭輕柔重懸。
8. 原生(shēng)質體培養：
将離心管水(shuǐ)平放(fàng)置，23-25oC弱光(guāng)培養。
注：根據實驗需求确定孵育時間。RNA分析孵育2-6小(xiǎo)時；酶活性分析和蛋白(bái)标記實驗孵育2-16小(xiǎo)時；基因編輯的效果在轉染24小(xiǎo)時後可能(néng)被檢測到(dào)。
三、實驗示例：
使用原生(shēng)質體植物(wù)原生(shēng)質體制備及轉化試劑盒轉染拟南(nán)芥原生(shēng)質體的效果圖。
實驗步驟：稱取0.48
g轉化試劑于2 ml 離心管中，加入轉化試劑溶解液後，颠倒混勻，蒸餾水(shuǐ)定容至2 ml，使轉化試劑充分溶解後備用。在2 ml的圓底離心管中加入10 μl（20 μg）EGFP質粒
(植物(wù)用綠色熒光(guāng)蛋白(bái))，加入100 μl制備好的原生(shēng)質體，輕柔混勻後加入110 μl當日配制好的轉化試劑溶液，輕柔混勻，常溫靜(jìng)置5
min後加入440 μl溶液II終止轉化，輕輕颠倒混勻，常溫100 g離心1 min，去除上(shàng)清，再加入0.5 ml溶液II，輕柔重懸原生(shēng)質體，常溫100 g離心1 min後，盡量去除上(shàng)清，收集原生(shēng)質體。加入1 ml溶液V，小(xiǎo)心重懸原生(shēng)質體後水(shuǐ)平放(fàng)置25℃培養過夜(約16h)，次日于熒光(guāng)顯微鏡下(xià)檢測EGFP熒光(guāng)信号。
四、 産品發表文章：
1
TaEXPB7-B,a-expansin gene involved in low-temperature stress and abscisic acid
responses, promotes growth and cold resistance in Arabidopsis thaliana.
Xu Feng,
Yongqing Xu, Lina Peng, Xingyu Yu, Qiaoqin Zhao, Shanshan Feng, Ziyi Zhao,
Fenglan Li, Baozhong Hu.
J Plant
Physiology 2019 https://doi.org/10.1016/j.jplph.2019.153004
2
Involvement of the chloroplast gene ferredoxin 1 in multiple responses of Nicotiana benthamiana to Potato virus X
infection.
Xue Yang,
Yuwen Lu, Fang Wang, Ying Chen, Yanzhen Tian, Liangliang Jiang, Jiejun Peng,
Hongying Zheng, Lin Lin, Chengqi Yan, Michael Taliansky, Stuart MacFarlane,
Yuanhua Wu, Jianping Chen，Fei Yan.
Journal of
Experimental Botany, 2020，71（6）2142–2156,
doi:10.1093/jxb/erz565
植物(wù)原生(shēng)質體提取試劑盒發表文章列表
1. [IF=3.19] TaEXPB7-B,a
-expansin gene involved in low-temperature stress and abscisic acid
responses, promotes growth and cold resistance in Arabidopsis thaliana.
實驗植物(wù)：小(xiǎo)麥
Author: Xu Feng, Yongqing Xu, Lina
Peng, Xingyu Yu, Qiaoqin Zhao, Shanshan Feng, Ziyi Zhao, Fenglan Li,
Baozhong Hu.
Journal: J Plant Physiology 2019
Institution： College
of Life Sciences, Northeast Agricultural University
Paper link：http://www.plantphysiol.org/content/174/4/2487
2. [IF=5.36] Involvement of the
chloroplast gene ferredoxin 1 in multiple responses of Nicotiana benthamiana to
Potato virus X infection.
實驗植物(wù)：煙(yān)草(cǎo)
Author: Xue Yang, Yuwen Lu, Fang Wang,
Ying Chen, Yanzhen Tian, Liangliang Jiang, Jiejun Peng, Hongying Zheng,
Lin Lin, Chengqi Yan, Michael Taliansky, Stuart MacFarlane, Yuanhua Wu,
Jianping Chen and Fei Yan
Journal: Journal of Experimental
Botany, 2020，Vol.71,
No. 6,2142–2156,
Institution：Institute
of Plant Virology, Ningbo University
Paper link：https://academic.oup.com/jxb/article/71/6/2142/5686178?login=true
3. [IF=7.228] Turnip mosaic
virus impairs perinuclear chloroplast clustering to facilitate viral infection
實驗植物(wù)：煙(yān)草(cǎo)
Author:Yushan Zhai, Quan Yuan, Shiyou Qiu,
Saisai Li, Miaomiao Li, Hongying Zheng, Guanwei Wu, Yuwen Lu, Jiejun Peng,
Shaofei Rao, Jianping Chen, Fei Yan
Journal: Plant Cell Enviroment, 2021，30
July
Institution：Institute
of Plant Virology, Ningbo University
Paper link：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pce.14157
4. [IF=5.64] A Novel, Small
Cysteine-Rich Effector, RsSCR10 in Rhizoctonia solani Is Sufficient to Trigger
Plant Cell Death
實驗植物(wù)：水(shuǐ)稻
Author:Xianyu Niu, Guijing Yang, Hui Lin,
Yao Liu, Ping Li and Aiping Zheng
Journal: Fronties in Microbiology August
2021 | Volume 12 | Article 684923
Institution：Sichuan
Agricultural University
Paper link：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2021.684923/full
5. [IF=9.8] Synthesis of
flavour-related linalool is regulated by PpbHLH1 and associated with changes in
DNA methylation during peach fruit ripening
實驗植物(wù)：煙(yān)草(cǎo)
Author: Chunyan Wei, Hongru Liu,
Xiangmei Cao, Minglei Zhang, Xian Li, Kunsong Chen and Bo Zhang
Journal: Plant Biotechnology
Journal (2021) 19, pp. 2082–2096
Institution：Laboratory
of Fruit Quality Biology/Zhejiang Provincial Key Laboratory of Horticultural
Plant Integrative Biology, Zhejiang University
Paper link：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13638
6. [2020IF=1.04] EoPHR2, a
Phosphate Starvation Response Transcription Factor, Is Involved in Improving
Low-Phosphorus Stress Resistance in Eremochloa ophiuroides
實驗植物(wù)：拟南(nán)芥
Author: Ying Chen1,#, Chuanqiang
Liu1,#, Qingqing He1, Jianjian Li2, Jingjing Wang2, Ling Li2, Xiang Yao2,
Shenghao Zhou3, Haoran Wang
Journal: Phyton Vol.91, No.3,
2022, pp.651-665
Institution： Institute
of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences
Paper link：https://www.techscience.com/phyton/v91n3/45309
7. [2021IF=3.2] Establishment
and optimization of PEG-mediated protoplast transformation in the microalga Haematococcus
pluvia
實驗材料：雨生(shēng)紅(hóng)球藻 Haematococcus
pluvia
Author: Chunli Guo，Muhammad
Anwar， Rui Mei，Xinyi
Li， Di Zhao，Yanan
Jiang， Jieyi
Zhuang， Chen Liu，Chaogang
Wang， Zhangli
Hu
Journal: Journal of Applied
Phycology. Published
online 07 March 2022
Institution：College
of Optoelectronic Engineering, Shenzhen University
Paper link： https://link.springer.com/article/10.1007/s10811-022-02718-x
8. [2021 IF=5.9] The Genome-Wide
Identification of Long Non-Coding RNAs Involved in Floral Thermogenesis in
Nelumbo nucifera Gaertn
實驗材料：睡(shuì)蓮 Nelumbo nucifera Gaertn
Author: Jing Jin , Yu Zou, Ying Wang,
Yueyang Sun, Jing Peng and Yi Ding
Journal: Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 4901.
Institution：College
of Life Sciences, Guizhou University，College
of Life Sciences, Wuhan University
Paper link： https://www.mdpi.com/1422-0067/23/9/4901
9. [2021 IF=17.9] Genome-wide association
analysis reveals a novel pathway mediated by a dual-TIR
domainprotein for pathogen resistance in cotton
實驗材料：棉花
Author: Yihao Zhang, Yaning Zhang,
Xiaoyang Ge, Yuan Yuan, Yuying Jin, Ye Wang, Lihong Zhao, Xiao Han, Wei Hu, Lan
Yang, Chenxu Gao, Xi Wei, Fuguang Li, Zhaoen Yang
Journal: Genome Biology (2023) 24:111
Institution：Institute
of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultura Sciences
Paper link： https://doi.org/10.1186/s13059-023-02950-9
10. [2022
IF=7.4] Rose long noncoding RNA lncWD83 promotes flowerin by modulating
ubiquitination of the floral repressor RcMYC2L
實驗材料：Rose 玫瑰
Author: Chen
Yeqing ,Lu Jun ,Wang Weinan ,Fan Chunguo
,Yuan Guozhen ,Sun Jingjing ,Liu Jinyi ,Wang Changquan
Journal: Plant Physiol (2023) Published: 19 September 2023
Institution：College
of Horticulture, Nanjing Agricultural University
Paper link： https://doi.org/10.1093/plphys/kiad502
11. [2022
IF=17.4] Functionalized carbon nano-enabled plant ROS signal engineering for
growth / defense balance
實驗材料：拟南(nán)芥
Author: Zhijiang
Guo , Qiong Chen , Taibo Liang , Baoyuan Zhou , Suhua Huang , Xiufeng Cao,
Xiuli Wang , Zaisong Ding, Jiangping Tu
Journal: Nano Today 53 (2023) 102045
Institution：School
of Materials Science and Engineering, Zhejiang University
Paper link：https://doi.org/10.1016/j.nantod.2023.102045
12. [2022
IF=13.8] Unveiling the mechanism of broad-spectrum blast resistance in rice:
The collaborative role of transcription factor OsGRAS30 and histone deacetylase
OsHDAC1
實驗材料：水(shuǐ)稻
Author: Jiaqi
Hou, Huangzhuo Xiao, Peng Yao, Xiaoci Ma, Qipeng Shi, Jin Yang, Haoli Hou and
Lijia Li
Journal: Plant Biotechnology Journal (2024), pp. 1–17
Institution：State
Key Laboratory of Hybrid Rice, College of Life Sciences, Wuhan University
Paper link：https://doi.org/10.1111/pbi.14299
13.
[2022 IF=7.2] NnSnRK1-NnATG1-mediated autophagic cell death governs flower bud abortion
in shaded lotus
實驗材料：荷花
Author: Xiehongsheng Li, Yingchun Xu,
Zongyao Wei, Jiaying Kuang, Mingzhao She, Yanjie Wang and Qijiang Jin
Journal: Plant J (2024) 117, 979–998
Institution：College of
Horticulture, Nanjing Agricultural University
Paper link： https://doi.org/10.1111/tpj.16655