植物(wù)原生(shēng)質體制備及轉化試劑盒
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貨号
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名稱
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包裝
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RTU4052
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植物(wù)原生(shēng)質體制備及轉化試劑盒
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5 ml×40次
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● 産品組成：
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組分貨号
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名稱
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規格
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貯存
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運輸
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RTU4052-01
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溶液I-酶溶解溶液（2×）
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100 ml
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-20℃
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RT
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RTU4052-02
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溶液II-漂洗溶液
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200 ml
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-20℃
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RT
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RTU4052-03
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溶液III-重懸溶液
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25 ml
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-20℃
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RT
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RTU4052-04
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組份IV-轉化試劑
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5 ml
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-20℃
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RT
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RTU4052-05
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溶液V-培養溶液
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25 ml
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-20℃
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RT
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BME
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還(hái)原劑
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1 ml
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RT
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RT
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50mg/ml BSA溶液
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5 ml
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-20℃
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RT
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說明書
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一(yī)份
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● 産品簡介：
植物(wù)原生(shēng)質體是指脫去全部細胞壁由質膜包被的具有生(shēng)命活力的裸露細胞。它具有細胞生(shēng)命特征和全能(néng)型，是細胞無性系變異和突變體篩選的重要來源，同時也是植物(wù)遺傳工(gōng)程的理想受體和遺傳改良的理想材料。酶解法分離原生(shēng)質體是一(yī)個(gè)常用的技(jì)術(shù)，其原理是植物(wù)細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶、離析酶和果膠酶能(néng)降解細胞壁成分，去除細胞壁，即可得到(dào)原生(shēng)質體。許多(duō)方法可誘導原生(shēng)質體融合，現在被廣泛采用的融合方法是聚乙二醇（PEG）法。聚乙二醇（PEG）作為(wèi)一(yī)種高(gāo)分子化合物(wù)，合适的濃度能(néng)對原生(shēng)質體産生(shēng)瞬間沖擊效應，原生(shēng)質體很快發生(shēng)收縮與粘連，随後用高(gāo)鈣高(gāo)pH法進行清洗，使原生(shēng)質體融合得以完成。
按照(zhào)每次使用5
ml酶消化體系計算(suàn)，本試劑盒可用于40次酶消化反應。本試劑盒每個(gè)5 ml反應體系可處理0.1 g左右的拟南(nán)芥葉片(約10~15葉片)，操作較好的情況下(xià)每5 ml體系可獲得約50-70萬個(gè)原生(shēng)質體(不同植物(wù)不同操作會(huì)有一(yī)定的差異)，可滿足約25-70個(gè)樣品的原生(shēng)質體質粒轉染操作(按照(zhào)每樣1-2萬個(gè)細胞計算(suàn))。
原生(shēng)質體轉化時，本試劑盒可以用于相(xiàng)當于6孔闆40個(gè)孔的樣品，12孔闆80個(gè)孔的樣品，或24孔闆160個(gè)孔的樣品的轉化。
● 貯存和效期：
-20oC保存，至少一(yī)年(nián)有效。
組分I，II，III，V 4℃存放(fàng)3-5天不會(huì)影響使用效果，長(cháng)期不用，按照(zhào)标簽℃貯存。
試劑盒常溫運輸。
● 使用說明：
需要準備的材料（試劑盒不提供）：
剪尖吸頭（剪尖後可以用酒精燈過火将吸頭處理平滑）；纖維素酶R-10；離析酶R-10；平頭鑷子；70μm細胞過濾篩；一(yī)次性刀片；50ml離心管；1.5ml離心管；水(shuǐ)浴鍋。
一(yī)、原生(shēng)質體分離：
即用型酶溶液配制
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5 ml配制量
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10 ml 配制量
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溶液I（2×）
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2.5
ml
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5
ml
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纖維素酶R-10
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0.075克
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0.15 克
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離析酶R-10
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0.02 克
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0.04 克
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混勻後 55℃水(shuǐ)浴 10 min，期間颠倒混勻 2-3次，冷卻至常溫後加入以下(xià)成分。
注：55oC孵育可以有效滅活DNase和Protease，并促進酶溶解
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還(hái)原劑
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2.5
μl
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5
μl
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50mg/ml
BSA
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0.1
ml
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0.2
ml
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滅菌水(shuǐ)
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定容至5 ml
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定容至10 ml
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注：即用型酶溶液現用現配，不建議配制後凍存後再使用；
溶解好的正常酶溶液應為(wèi)澄清棕黃色溶液，如使用純度不好的酶，溶液為(wèi)不溶解的乳白(bái)色懸濁液，不能(néng)使用。
1. 酶解：
取生(shēng)長(cháng)狀态良好的葉片切成0.5-1 mm的小(xiǎo)條，按照(zhào)0.1
克葉片（拟南(nán)芥約15-20個(gè)葉片）加5
ml即用型酶溶液的比例迅速将切割好的葉片小(xiǎo)條浸泡于酶溶液中，避光(guāng)，無需震蕩，常溫（20-25℃）酶解3小(xiǎo)時，間歇混勻。
注：酶解時間與葉片種類，葉片生(shēng)長(cháng)狀态有關，請根據實驗需要适當調整酶解時間。3小(xiǎo)時為(wèi)拟南(nán)芥葉片推薦的酶解時間。如條件(jiàn)允許，可以使用微型真空泵常溫避光(guāng)條件(jiàn)下(xià)抽真空30 min，以使酶溶液更好地進入細胞間隙。酶溶液變為(wèi)綠色表明有原生(shēng)質體已經有分離，溶液為(wèi)濃綠色表明原生(shēng)質體已經大量分離。拟南(nán)芥原生(shēng)質體大小(xiǎo)約為(wèi)30-50 μm，顯微鏡鏡檢後确定是否分離。葉片原生(shēng)質體細胞顯微鏡下(xià)為(wèi)綠色圓球狀，葉綠體分散在整個(gè)細胞内，說明狀态較好；如呈現不規則形狀，說明原生(shēng)質體破碎或即将破碎。
2. 漂洗：
酶解後加入等體積的溶液II，如使用5 ml酶解體系，加入5 ml溶液II，輕柔混勻。
3. 過濾：
用孔徑70 μm篩網過濾步驟2中的溶液，去除未消化的葉片，收集濾出液于50 ml離心管中。
4. 第一(yī)次收集：
濾出液100g常溫離心 2分鍾，盡量去除上(shàng)清。
注：為(wèi)了避免原生(shēng)質體離心時貼在管壁，建議整個(gè)實驗過程使用水(shuǐ)平轉頭；離心時，可調低(dī)離心機(jī)的升速和降速。升速過快，原生(shēng)質體可能(néng)離到(dào)管壁上(shàng)；降速過快，可能(néng)導緻管底原生(shēng)質體懸起。
5. 第二次收集：
加入2-5 ml 溶液II，用剪尖的藍吸頭重懸原生(shēng)質體，冰浴30分鍾，原生(shēng)質體在重力作用下(xià)可以沉降到(dào)離心管底部，盡量吸除上(shàng)清，收集原生(shēng)質體。(如果發現原生(shēng)質體沉降的速度比較慢(màn)或者得率比較低(dī)，也可以考慮常溫100 g離心1-2 min收集原生(shēng)質體)。
6. 重懸：
小(xiǎo)心去除上(shàng)清溶液，不要觸動原生(shēng)質體沉澱，沉澱用剪尖的藍吸頭重懸于1 ml溶液III中即為(wèi)原生(shēng)質體溶液。（可以用血球計數闆計數，根據原生(shēng)質體數量調整溶液III的加入體積，使得原生(shēng)質體密度為(wèi)2×105/ml或更高(gāo)）。
注：制備好的原生(shēng)質體可以在4oC或冰浴保存至少24 h。
二、原生(shēng)質體轉化和培養：
1. 轉化溶液配制：
植物(wù)原生(shēng)質體轉化參考下(xià)表根據樣品量配制轉化溶液。
轉化溶液現用現配。轉化溶液需要在轉化前至少1小(xiǎo)時配制，以确保轉化試劑溶解充分。轉化溶液配制後盡量當天使用。配制好的轉化溶液4℃保存3-5天之内仍然有較好的轉化效率，但和當天配制的轉化溶液相(xiàng)比，轉化效果可能(néng)會(huì)有一(yī)定程度的下(xià)降。
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120 μl
（1個(gè)樣品）
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1.2 ml
（10個(gè)樣品）
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5 ml
(約40個(gè)樣品)
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轉化試劑粉末
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48
mg
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480
mg
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2
g
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轉化試劑溶解液（2×）
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60
μl
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0.6
ml
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2.5
ml
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滅菌水(shuǐ)
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定容至120 μl
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定容至1.2 ml
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定容至5 ml
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2. 準備質粒：
取10 μl質粒DNA(10-20
μg，濃度為(wèi)1-2 μg/μl)于1.5 ml 離心管中。
注：質粒大小(xiǎo)建議為(wèi)5-10
kb，質粒濃度為(wèi)1-2 μg/μl左右；
原生(shēng)質體轉化對于質粒的純度要求較高(gāo)，盡量使用高(gāo)純度的質粒。
3. 質粒轉化：
3.1 質粒管中加入100 μl原生(shēng)質體溶液（原生(shēng)質體密度為(wèi)2×105/ml，約2萬個(gè)原生(shēng)質體），輕柔混勻。
3.2 加入等體積即110 μl 步驟1事(shì)先準備好的轉化溶液，輕彈管底，輕柔混勻，常溫25℃放(fàng)置5-15分鍾。
注：最長(cháng)可以孵育15 min，但通(tōng)常孵育5min時間已經足夠。最佳的孵育時間對于不同的原生(shēng)質體和不同的質粒需要通(tōng)過實驗摸索。
4. 終止轉化：
加入2倍體積即440 μl 溶液II，輕柔徹底混勻，終止轉化過程。
5. 收集原生(shēng)質體：
常溫100g離心1-2分鍾，盡量去除上(shàng)清。
注：由于轉化後的溶液會(huì)非常粘稠，加入溶液II後離心1
min通(tōng)常可以使原生(shēng)質體聚集在管底，但使用某些突變體時為(wèi)減少原生(shēng)質體損失，可将離心時間延長(cháng)到(dào)2 min。
6. 原生(shēng)質體漂洗：
加入500 μl溶液II輕輕重懸原生(shēng)質體，常溫100g離心1 min，盡量去除殘留的上(shàng)清。注：本步驟可以充分去除殘留的轉染試劑溶液中的組分，避免轉染試劑溶液中的組分對于後續的不良影響。
7. 原生(shēng)質體重懸：
沉澱中加入1
ml溶液V，輕柔重懸。
8. 原生(shēng)質體培養：
将離心管水(shuǐ)平放(fàng)置，23-25oC弱光(guāng)培養。
注：根據實驗需求确定孵育時間。RNA分析孵育2-6小(xiǎo)時；酶活性分析和蛋白(bái)标記實驗孵育2-16小(xiǎo)時；基因編輯的效果在轉染24小(xiǎo)時後可能(néng)被檢測到(dào)。
三、實驗示例：
使用原生(shēng)質體植物(wù)原生(shēng)質體制備及轉化試劑盒轉染拟南(nán)芥原生(shēng)質體的效果圖。
實驗步驟：稱取0.48
g轉化試劑于2 ml 離心管中，加入轉化試劑溶解液後，颠倒混勻，蒸餾水(shuǐ)定容至2 ml，使轉化試劑充分溶解後備用。在2 ml的圓底離心管中加入10 μl（20 μg）EGFP質粒
(植物(wù)用綠色熒光(guāng)蛋白(bái))，加入100 μl制備好的原生(shēng)質體，輕柔混勻後加入110 μl當日配制好的轉化試劑溶液，輕柔混勻，常溫靜(jìng)置5
min後加入440 μl溶液II終止轉化，輕輕颠倒混勻，常溫100 g離心1 min，去除上(shàng)清，再加入0.5 ml溶液II，輕柔重懸原生(shēng)質體，常溫100 g離心1 min後，盡量去除上(shàng)清，收集原生(shēng)質體。加入1 ml溶液V，小(xiǎo)心重懸原生(shēng)質體後水(shuǐ)平放(fàng)置25℃培養過夜(約16h)，次日于熒光(guāng)顯微鏡下(xià)檢測EGFP熒光(guāng)信号。
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