DNase I（RNase-free）
● 産品組成：
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貨号
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名稱
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規格
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RTT2104-01
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DNase
I （RNase-free） 1 U/μl
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200 U
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RTT2104-02
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10×DNase
Reaction Buffer
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0.2 ml
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RTT2104-03
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10×EDTA終止液（25
mM）
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0.2 ml
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-
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RNase-free水(shuǐ)
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1 ml
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● 保存： -20℃貯存，有效期一(yī)年(nián)。
● 産品簡介：
DNase I，即Deoxyribonuclease
I，中文名稱為(wèi)脫氧核糖核酸酶I，是一(yī)種可以消化單鏈或雙鏈DNA産生(shēng)單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸内切酶。DNase
I水(shuǐ)解單鏈或雙鏈DNA後的産物(wù)，5'端為(wèi)磷酸基團，3'端為(wèi)羟基。 DNase I活性依賴于鈣離子，并能(néng)被鎂離子或二價錳離子激活。鎂離子存在條件(jiàn)下(xià)，
DNase I可随機(jī)剪切雙鏈DNA的任意位點；二價錳離子存在條件(jiàn)下(xià)，DNase
I 可在同一(yī)位點剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個(gè)核苷酸突出的粘末端。該DNase I不含RNase
(RNase free)，可以用于各種RNA樣品的處理。提供了用于DNase I失活所需的EDTA。
用途：制備不含DNA的RNA樣品；RT-PCR反應前RNA樣品中去除基因組DNA等可能(néng)的DNA污染；體外T7, T3, SP6等RNA
Polymerases催化的RNA轉錄後去除DNA模闆；DNase
I footprinting研究DNA-蛋白(bái)質相(xiàng)互作用；缺口平移(nick
translatioin)；産生(shēng)DNA随機(jī)片段文庫；細胞凋亡TUNEL檢測中部分剪切基因組DNA作為(wèi)陽性對照(zhào)。
● 活性定義：
One unit of
the enzyme completely degrades 1 μg of DNA in 10 min at37°C.
● DNaseI貯存緩沖液：
50mM
Tris-acetate (pH7.5)，10mM CaCl2，50% (v/v) glycerol
10×DNase Reaction Buffer：100m M Tris-HCl (pH7.5 at 25oC)，25mM MgCl2，1mM CaCl2
● DNaseI失活或抑制：
加入EDTA至終濃度為(wèi)2.5mM後，65℃加熱10分鍾可使DNase I失活。酚氯仿抽提也可以使DNase I失活。金屬離子螯合劑，達到(dào)毫摩爾/升濃度的鋅離子，0.1%的SDS，DTT、巯基乙醇等還(hái)原劑，50-100mM以上(shàng)鹽濃度均對DNase I有顯著抑制作用。
● 使用方法：
一(yī) RT-PCR反應前RNA樣品中DNA的去除：
1.在RNase-free離心管中加入以下(xià)溶液：
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組份
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10μl反應體系
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備注
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RNA溶液
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1-3
μg
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RNA加入體積小(xiǎo)于8
μl
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10×DNase Reaction
Buffer
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1
μl
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DNase I (RNase-free) 1 U/μl
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1
μl
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RNase-free水(shuǐ)
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補至10μl
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輕柔混勻
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2.
37oC
孵育
30 分鍾。
3.
向上(shàng)述反應體系中加入
1μl 10×EDTA終止液，65oC
孵育
10 分鍾以失活
DNase I。
注：在沒有鏊合劑如
EDTA存在情況下(xià)加熱，RNA
可被水(shuǐ)解。
4.
RNA樣品即可直接用作RT-PCR反應的模闆。
二 體外RNA反轉錄後模闆DNA的去除：
1. 在每含有0.5 μg模闆DNA的反轉錄反應體系中加入1U DNase I。
注：在某些情況下(xià)，模闆DNA完全消化所需的DNase的量需通(tōng)過實驗進行摸索。
2. 37oC
孵育15分鍾。
3. 酚/氯仿抽提失活DNase I。
三 體外RNA反轉錄後模闆DNA的去除：
1. 參考如下(xià)表格設置反應體系：
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組份
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體積
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10×Reaction
Buffer for DNA Polymerase I
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2.5
μl
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3
dNTP Mixture (1mM each, without the
labeled dNTP) *
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1.25
μl
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[α-32P]-dNTP,
~110TBq/mmol (3000Ci/mmol)
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1.85-3.7MBq
(50-100μCi)
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DNase
I (freshly diluted to 0.002U/μl)**
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1
μl
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DNA
Polymerase I, E.coli
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Template
DNA
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0.25μg
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RNase-free水(shuǐ)
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至25μl
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*3
dNTP Mixture (1mM each, without the
labeled dNTP)：分别取不含已經标記的 dNTP 外的 3 種 dNTP(100mM) 各 1μl 加入到(dào) 97 μl 的RNase-free水(shuǐ)中混勻即可。例如标記的為(wèi)
dATP，則需混合
dTTP、dCTP
和
dGTP 三種
dNTP 至每種的最終濃度為(wèi)
1 mM。配制好的
dNTP 可存放(fàng)于-20oC
以備後續使用。
**DNase
I 可以用
1X Reaction Buffer for DNA Polymerase I 進行稀釋。
10×Reaction
Buffer for DNA Polymerase I：500mM Tris-HCl (pH7.5 at 25oC)，100mM
MgCl2，10mM DTT。
2.
立即
15oC 孵育
15~60 分鍾。
3.
上(shàng)述反應體系中加入1
μl of 0.5M EDTA(pH 8.0)終止反應。
4.
從(cóng)中取出少量例如1
μl 檢測标記效率。通(tōng)常标記效率至少可以達到(dào)
108cpm/μg DNA。