T4連接酶
T4 DNA ligase
貨号：RTT2101
● 産品組成：
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名稱
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規格
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T4 DNA ligase (5U/μl)
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100 U (20μl)
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10×T4 DNA Ligation Buffer
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0.2 ml
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50%PEG Solution
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0.15 ml
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● 保存：-20℃
● 産品簡介：
T4 DNA
Ligase 是從(cóng)表達T4
DNA Ligase 基因的大腸杆菌經誘導表達後分離純化而來的，催化相(xiàng)鄰DNA鏈的5’磷酸基團和3’羟基基團以磷酸二酯鍵結合反應。該酶可催化平末端或粘性末端DNA之間的連接，還(hái)可修複雙鏈DNA、RNA、DNA/RNA雜(zá)交雙鏈中的單鏈切口。本品可應用于DNA插入片段和載體DNA的粘性末端和平末端的連接，以及線性DNA的自(zì)身環化。
活性定義：此酶的活力單位為(wèi)Weiss Unit。1個(gè)Weiss
Unit相(xiàng)當于約200個(gè)粘性末端連接單位（cohesive-end
ligation unit, CEU）。1個(gè)CEU單位定義為(wèi)在20 μl的連接反應體系中，在16℃30分鍾内，能(néng)使50%的經HindIII消化的λDNA片段連接所需的酶量。
● 注意事(shì)項
1．T4
DNA Ligase的最終用量不要超過推薦的用量，否則影響連接效率。
2．PEG可以極大提高(gāo)平末端的連接效率，我們推薦加入終濃度為(wèi)5%
PEG Solution以提高(gāo)平末端的連接效率。
3．為(wèi)了提高(gāo)轉化效率，轉化時建議所加入連接産物(wù)的量不要超過感受态細胞體積的10%。
4．由于T4
DNA Ligase中含有甘油，比較粘稠容易挂壁，建議使用前短暫離心将液體收集到(dào)管底，取樣時槍頭盡量不要深入液面太深以免粘在槍頭上(shàng)造成損失。
● 使用方法：
一(yī)
DNA片段和載體DNA的連接
1）粘性末端的連接
1．反應體系:
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10μl體系
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終濃度
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線性載體DNA
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x μl
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10-50 ng
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插入DNA片段
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y μl
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插入片段：載體=1:1-5:1*
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10×ligation
buffer
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1 μl
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1×
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T4 DNA
ligase(5U/μl)
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0.1 μl
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0.5 U
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ddH2O
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up to 10 μl
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*：載體與插入片段的摩爾數比需要優化：一(yī)般vector:insert在1:1~1:5之間均可得到(dào)較好的結果。用以下(xià)公式計算(suàn)片段摩爾數：pmol數= DNA量(ng)/(660×片段bp數)×1000。例如：插入片段2000bp，線性載體為(wèi)3000bp，如果載體使用量為(wèi)50ng（0.025pmol），10μl連接體系中vector:insert的摩爾比是1:3，則需要2000bp pmol數為(wèi)0.075pmol，插入片段2000bp的使用量為(wèi)100ng。
2．徹底輕柔混勻後，瞬間離心，将管壁上(shàng)的溶液收集到(dào)管底。
3．反應條件(jiàn)：16℃孵育30分鍾。
4．可取5
μl連接産物(wù)熱擊轉化50
μl感受态細胞或取1-2
μl連接産物(wù)電(diàn)擊轉化50
μl感受态細胞。
注：1）若要提高(gāo)電(diàn)轉實驗效率，推薦65℃孵育10分鍾或70℃孵育5分鍾以滅活T4 DNA Ligase後，用DNA産物(wù)純化試劑盒對連接後的DNA片段進行純化後進行電(diàn)擊轉化。
2）若要提高(gāo)轉化子數目，可将連接時間延長(cháng)至1小(xiǎo)時。
3）在10
μl連接體系中若T4連接酶的終濃度大于1
U，必須對連接後的DNA片段進行純化後方可進行電(diàn)轉。
2）平末端的連接
1．反應體系:
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10μl體系
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終濃度
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線性平末端載體DNA*
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x μl
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10-50 ng
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插入DNA片段
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y μl
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插入片段：載體=1:1-5:1**
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10×ligation
buffer
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1 μl
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1×
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T4 DNA
ligase(5U/μl)
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0.5 μl
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2.5 U
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50% PEG
solution
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1 μl
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5%
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ddH2O
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up to 10 μl
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*：平滑末端的載體與 DNA 片段進行連接時，應首先将載體進行去磷酸化處理，以防止其自(zì)身環化。
**：載體與插入片段的摩爾數比需要優化：一(yī)般vector:insert在1:1~1:5之間均可得到(dào)較好的結果。用以下(xià)公式計算(suàn)片段摩爾數：pmol數= DNA量(ng)/(660×片段bp數)×1000。例如：插入片段2000bp，線性載體為(wèi)3000bp，如果載體使用量為(wèi)50ng（0.025pmol），10μl連接體系中vector:insert的摩爾比是1:3，則需要2000bp pmol數為(wèi)0.075pmol，插入片段2000bp的使用量為(wèi)100ng。
2．徹底輕柔混勻後，瞬間離心，将管壁上(shàng)的溶液收集到(dào)管底。
3．反應條件(jiàn)：16℃孵育30分鍾。
4．可取5
μl連接産物(wù)熱擊轉化50
μl感受态細胞或取1-2
μl連接産物(wù)電(diàn)擊轉化50
μl感受态細胞。
注：1）由于平末端連接體系中，T4 ligase用量較大，若要提高(gāo)電(diàn)轉實驗效率，推薦65℃孵育10分鍾或70℃孵育5分鍾以滅活T4
DNA Ligase後，用DNA産物(wù)純化試劑盒或氯仿抽提對連接後的DNA片段進行純化後才能(néng)進行電(diàn)擊轉化。
2）若要提高(gāo)轉化子數目，可将連接時間延長(cháng)至1小(xiǎo)時。
二 線性DNA的自(zì)身環化
1．反應體系:
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50μl體系
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終濃度
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線性載體DNA
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x μl
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10-50 ng
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10×ligation
buffer
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5 μl
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1×
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T4 DNA
ligase(5U/μl)
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1 μl
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5 U
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ddH2O
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up to 50 μl
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2．徹底輕柔混勻後，瞬間離心，将管壁上(shàng)的溶液收集到(dào)管底。
3．反應條件(jiàn)：16℃孵育30分鍾。
4．可取5
μl連接産物(wù)熱擊轉化50
μl感受态細胞或取1-2
μl連接産物(wù)電(diàn)擊轉化50
μl感受态細胞。
注：1）若要提高(gāo)電(diàn)轉實驗效率，推薦65℃孵育10分鍾或70℃孵育5分鍾滅活T4 DNA Ligase後，用DNA産物(wù)純化試劑盒或氯仿抽提對連接後的DNA片段進行純化後才能(néng)進行電(diàn)擊轉化。
三 接頭連接
1．反應體系:
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20μl體系
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終濃度
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線性DNA
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x μl
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100-500 ng
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磷酸化接頭
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y μl
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1-2 μg
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10×ligation
buffer
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2 μl
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1×
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50% PEG
solution
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2 μl
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5%
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T4 DNA
ligase(5U/μl)
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0.4 μl
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2 U
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ddH2O
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up to 20 μl
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2．徹底輕柔混勻後，瞬間離心，将管壁上(shàng)的溶液收集到(dào)管底。
3．反應條件(jiàn)：16℃孵育30分鍾。
4．65℃孵育10分鍾或70℃孵育5分鍾滅活T4
DNA Ligase。連接産物(wù)可以直接進行限制性内切酶酶切反應。