RealPure®Plant Seed RNA Extraction Kit
RealPure®植物(wù)種子RNA提取試劑盒
● 試劑盒内容及保存：
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試劑盒組成
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RTR2308-01 （50次）
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貯存方式
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裂解液RSL
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30
ml
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常溫
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緩沖液PRS
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3
ml
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常溫
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裂解液RL
plus
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30
ml
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常溫
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去蛋白(bái)液RD
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30
ml
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常溫
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漂洗液RW（濃縮液）
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25
ml
首次使用按照(zhào)标簽加入無水(shuǐ)乙醇
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常溫
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RNase-free水(shuǐ)
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5
ml
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4℃
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DNA清除柱CS（RNase-free）
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50個(gè)
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常溫
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RNA吸附柱CR（RNase-free）
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50個(gè)
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常溫
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收集管
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100個(gè)
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常溫
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2
ml離心管（RNase-free）
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50個(gè)
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常溫
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1.5
ml離心管（RNase-free）
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150個(gè)
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常溫
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說明書
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1份
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● 儲存條件(jiàn)和效期：
RNase-free水(shuǐ)4℃保存；其他試劑在常溫（25℃左右）幹燥條件(jiàn)下(xià)，可保存1年(nián)。試劑盒常溫運輸。
● 産品簡介：
本試劑盒可從(cóng)植物(wù)種子中快速提取總RNA，通(tōng)過獨特的裂解系統，快速去除植物(wù)組織中的澱粉、多(duō)糖等成分，釋放(fàng)
RNA。試劑盒配套緩沖液PRS（Phenolic Remove Solution）可以去除種子中的多(duō)糖多(duō)酚對RNA提取的影響。另外，試劑盒配套DNA清除柱，可以消除基因組DNA的污染。整個(gè)提取過程僅需20-30分鍾内即可完成，可以從(cóng)50
mg植物(wù)種子中提取數十微克高(gāo)純度RNA，基本沒有DNA和蛋白(bái)的污染，可用于Northern
blot、Dot blot、polyA
篩選、體外翻譯、RNase 保護分析和分子克隆等實驗。
已經測試的植物(wù)種子有：拟南(nán)芥幹種子、小(xiǎo)麥幹種子、水(shuǐ)稻幹種子、芝麻種子、玉米幹種子、豌豆種子、紅(hóng)豆幹種子、綠豆幹種子、向日葵種子、西(xī)瓜種子、油莎豆、花生(shēng)、大豆等。另外，該試劑盒也适合于提取塊莖、鱗莖的RNA。
植物(wù)RNA提取介紹：
由于植物(wù)種類繁多(duō)，不同的植物(wù)種類和部位的樣品使用本試劑盒效果不同。我們已經測試成功的植物(wù)列表如下(xià)：
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植物(wù)樣品種類
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提取植物(wù)材料
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是否添加緩沖液PRS
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推薦裂解液
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RNA質量度
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RNA得量
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A260/280
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A260/230
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簡單植物(wù)葉片、幼苗、莖
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玉米葉片
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-
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裂解液RL
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30-40 μg/100 mg
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小(xiǎo)麥葉片
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-
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裂解液RL
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40-50 μg/100 mg
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水(shuǐ)稻葉片
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-
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裂解液RL
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45-55 μg/100 mg
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拟南(nán)芥葉片
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-
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裂解液RL
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10-15 μg/100 mg
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煙(yān)草(cǎo)葉片
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-
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裂解液RL
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40-55 μg/100 mg
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綠蘿葉片
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-
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裂解液RL
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1.87
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2.21
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5-10 μg/100 mg
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多(duō)糖多(duō)酚植物(wù)葉片
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銀(yín)杏葉片
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+
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裂解液RL
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10-15 μg/50 mg
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松針
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+
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裂解液RL
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10-15 μg/50 mg
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毛白(bái)楊葉片
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+
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裂解液RL
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20-30 μg/50 mg
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冬青葉片
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+
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裂解液RL
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1-5 μg/50 mg
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法國(guó)梧桐樣品
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+
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裂解液RL
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2.14
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1.97
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10-20 μg/50 mg
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種子
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黃豆種子
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+
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裂解液RSL
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40-50 μg/50 mg
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花生(shēng)種子
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+
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裂解液RSL
|
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20-25 μg/50 mg
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玉米種子
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+/-
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2.00
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2.37
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20-40 μg/50 mg
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水(shuǐ)稻種子
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+
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裂解液RSL
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5-10 μg/50 mg
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小(xiǎo)麥種子
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+/-
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裂解液RSL
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2.03
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2.28
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10-15 μg/50 mg
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高(gāo)粱種子
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+
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裂解液RSL
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|
|
5-10 μg/50 mg
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綠豆種子
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+
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裂解液RSL
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|
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5-10 μg/50 mg
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油莎豆
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+
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裂解液RSL
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2.26
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2.17
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7-15 μg/50mg
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拟南(nán)芥種子
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+
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裂解液RSL
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2.17
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1.98
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3-5μg/50mg
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南(nán)瓜籽
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+
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裂解液RSL
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2.27
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1.68
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10-15μg/50mg
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水(shuǐ)果果肉
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芒果
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+
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裂解液RL
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1-2 μg/50 mg
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西(xī)紅(hóng)柿
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+
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裂解液RL
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2-3 μg/50 mg
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蘋果
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+
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裂解液RL
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3-5 μg/50 mg
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西(xī)瓜
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+
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裂解液RL
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1-2μg/50 mg
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香蕉
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+
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裂解液RL
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2-3 μg/50 mg
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梨
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+
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裂解液RL
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3-5 μg/50 mg
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真菌材料
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香菇菌絲體
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-
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裂解液RL/RSL
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2-3 μg/100 mg
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平菇菌絲體
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-
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裂解液RL
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2-3 μg/100 mg
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塊莖
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馬鈴薯
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+/-
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裂解液RSL
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10-15 μg/50 mg
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紫薯
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+/-
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裂解液RSL
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2.35
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1.91
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2-5 μg/50 mg
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注：+ 表示添加，-表示不添加， +/- 表示添加不添加均可， NA表示無數據
● 準備工(gōng)作：
1操作前在裂解液RSL中加入β-巯基乙醇至終濃度5%，如500
μl RSL中加入25
μl β-巯基乙醇。此裂解液最好現用現配。配好的
RSL4 ℃可放(fàng)置3天。
2
按照(zhào)标簽所示在漂洗液RW中加入無水(shuǐ)乙醇（自(zì)備），混勻後蓋緊瓶蓋後常溫貯存備用。
3
準備65℃水(shuǐ)浴
4
所有離心步驟均在常溫下(xià)進行。
● 操作步驟：
1. 樣品處理:
1.1 1.5 ml RNase-free離心管中加入500 μl裂解液RSL（使用前請先檢查是否已加入β-巯基乙醇），50
μl緩沖液PRS混勻備用。
注：緩沖液PRS有助于去除樣品中的多(duō)糖和多(duō)酚，禾本科植物(wù)如水(shuǐ)稻，小(xiǎo)麥和玉米的種子RNA提取中可以不用添加；如不能(néng)判斷材料是否含多(duō)糖和多(duō)酚，請加入緩沖液PRS。
1.2将種子加入到(dào)液氮預冷的研缽中，用研杵研磨，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀。取20-50 mg粉末迅速加入到(dào)離心管中，渦旋劇烈震蕩混勻，65℃水(shuǐ)浴放(fàng)置5分鍾，間歇混勻。
注：一(yī)定不要加入超過50 mg的粉末，否則樣品超過裂解液RSL的裂解能(néng)力導緻RNA提取失敗。
2. 離心取上(shàng)清：
13,000 rpm離心5
min，小(xiǎo)心吸取收集管中的上(shàng)清至1.5 ml RNase-free的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細胞碎片沉澱。一(yī)般可獲得400 μl上(shàng)清。
注：一(yī)些種子富含油脂如花生(shēng)種子，離心後脂肪位于最上(shàng)層，用吸頭穿越脂肪層吸取上(shàng)清；禾本科植物(wù)如水(shuǐ)稻，小(xiǎo)麥，玉米，高(gāo)粱種子會(huì)有大量沉澱生(shēng)産。
3. 去除基因組污染：
上(shàng)清中加0.5倍體積的無水(shuǐ)乙醇（如400 μl上(shàng)清中加入200 μl無水(shuǐ)乙醇），混勻（此時可能(néng)會(huì)出現沉澱），得到(dào)的溶液和沉澱一(yī)起轉入DNA清除柱CS（清除柱放(fàng)入收集管中）中，13,000 rpm離心2分鍾，棄掉收集管中的廢液。
注：吸附柱的最大容積是850 μl，超過此體積分步上(shàng)柱，确保全部溶液都通(tōng)過過濾柱，如果膜上(shàng)有殘留液體，延長(cháng)離心時間至5分鍾，保證膜上(shàng)無殘留液體。
4. 洗脫RNA：
将DNA清除柱放(fàng)入2 m l RNase-free離心管中，在清除柱中加入500
μl 裂解液RL plus，13,000 rpm離心1分鍾，收集濾液（注意：RNA在濾液中，不要丢棄），濾液中加入250 μl無水(shuǐ)乙醇，此時可能(néng)會(huì)出現沉澱，立即混勻，不要離心。
5. RNA挂柱：
将全部溶液加入到(dào)RNA吸附柱CR中（吸附柱放(fàng)入收集管中），13,000 rpm離心2分鍾，棄廢液。
注：确保溶液全部過濾到(dào)收集管中，膜上(shàng)無殘留，如有必要，可以延長(cháng)離心時間至5分鍾。
6. 去除RNA中的蛋白(bái)污染：
向RNA吸附柱CR中（吸附柱放(fàng)入收集管中）加入500 μl 去蛋白(bái)液RD，13,000
rpm離心1分鍾，棄廢液。
7. 去除RNA中的其他雜(zá)質：
向RNA吸附柱CR中加入700
μl漂洗液RW（使用前請先檢查是否已加入乙醇）， 13,000 rpm離心1分鍾，棄廢液。
8. 進一(yī)步去除RNA中的其他雜(zá)質：
向吸附柱CR中加入500
μl漂洗液RW （使用前請先檢查是否已加入乙醇），13,000 rpm離心1
分鍾，棄廢液。
9. 關鍵步驟：徹底去除吸附柱上(shàng)的殘餘乙醇：
将吸附柱CR放(fàng)回收集管中，确保蓋好吸附柱管蓋，13,000 rpm将吸附柱CR空甩離心2 分鍾，去除吸附柱上(shàng)的殘餘液體。
注：此步驟目的是将吸附柱中殘餘的漂洗液去除，如果有漂洗液殘留，可能(néng)會(huì)影響後續的RT等實驗操作。
10. 洗脫得到(dào)RNA：
将RNA吸附柱CR轉入一(yī)個(gè)新的1.5 ml RNase-free離心管中，向吸附柱O型墊圈中央懸空加入50-100 μl RNase-free水(shuǐ)（事(shì)先65℃預熱可提高(gāo)洗脫效率），蓋好吸附柱管蓋，常溫放(fàng)置2分鍾，13,000
rpm離心2 分鍾。
注：确保水(shuǐ)要加到(dào)膜的中央，不要貼壁加入；洗脫緩沖液體積不應少于50
μl，體積過小(xiǎo)影響回收效率。
11. RNA貯存：
RNA樣品-80℃中保存。
● RNA産量和質量的評估：
1.
RNA産量：
用分光(guāng)光(guāng)度計測定OD260的吸光(guāng)值來計算(suàn)RNA産量。将RNA按照(zhào)一(yī)定的比例稀釋于TE溶液（10mMTris pH8.0，1mMEDTA）中，根據以下(xià)公式計算(suàn)：
A260×稀釋倍數×40=μg
RNA/ml
注：測定OD值時，盡量不要用RNase-free水(shuǐ)稀釋RNA，因為(wèi)RNase-free水(shuǐ)pH較低(dī)，測定的OD值偏低(dī)。
2.
RNA質量：
凝膠電(diàn)泳檢測：凝膠電(diàn)泳中，完整的RNA應該有兩條主帶：28S和18S，并且28S亮度應該與18S相(xiàng)當或是其亮度的2倍。可以使用普通(tōng)的1×TAE瓊脂糖凝膠電(diàn)泳，凝膠濃度1.5
%，可以使用高(gāo)電(diàn)壓，短時間電(diàn)泳，如7V/cm電(diàn)泳，20分鍾。建議使用D2000
DNA ladder（Cat：RTM415）作為(wèi)Marker。植物(wù)28S rRNA遷移率與1500 bp類似，18S rRNA遷移率與1000bp類似。
吸光(guāng)值檢測：可以用A230，A260和A280的數值表示RNA的純度。純淨的RNA的
A260/A280比值應該為(wèi)2，我們得到(dào)的RNA樣品比值應在1.8-2.2之間，如果比值低(dī)于1.8，表明RNA樣品中蛋白(bái)污染比較嚴重。
A260/A230比值應該在2-2.2之間。如果此比值低(dī)于2，表明RNA樣品中有胍鹽，多(duō)糖的污染。
實驗示例：
RTR2308 RealPure植物(wù)種子RNA提取試劑盒發表文章列表：
1. [2022
IF=6.5] Metabolic pathways modulated by coumarin to inhibit seed
germination and early seedling growth in Eleusine
indica.
植物(wù)：牛筋草(cǎo)
Author: Tai-Jie Zhang, Zhao Ma, Hong-Ju Ma, Xing-Shan Tian, Wen-Lei Guo,
Chun Zhang.
Journal: Plant Physiology and Biochemistry 203 (2023) 108035
Institution: Institute of Plant Protection, Guangdong Academy of
Agricultural Sciences
Paper
link：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0981942823005466