RealPure Bacterial RNA Extraction Kit

RealPure細菌RNA提取試劑盒

● 試劑盒内容及保存：

● 儲存條件(jiàn)和效期：

RNase-free水(shuǐ)和溶菌酶4℃保存；其他試劑在常溫（25℃左右）幹燥條件(jiàn)下(xià)，可保存1年(nián)。試劑盒常溫運輸。

● 産品簡介：

本試劑盒适用于快速提取細菌總RNA，使用DNA清除柱CS确保有效濾除gDNA殘留，不需要使用DNase消化，得到(dào)的RNA可直接用于反轉錄PCR，熒光(guāng)定量PCR.。

● 準備工(gōng)作：

1操作前在裂解液RL中加入β-巯基乙醇至終濃度1%，如500 μl RSL中加入5 μl β-巯基乙醇。此裂解液最好現用現配。配好的 RSL4 ℃可放(fàng)置3天。

2 按照(zhào)标簽所示在漂洗液RW中加入無水(shuǐ)乙醇（自(zì)備），混勻後蓋緊瓶蓋後常溫貯存備用。

3 按照(zhào)标簽所示在溶菌酶中加入TE溶液，混勻溶解後-20℃貯存。

4 所有離心步驟均在常溫下(xià)進行。

● 操作步驟：

1. 樣品處理和裂解:

1.1 1-2 ml菌液(約10⁸-10⁹細胞)加入到(dào)1.5 ml離心管中，13000 rpm 離心2 分鍾，棄上(shàng)清，離心快甩，用移液器(qì)吸頭盡可能(néng)吸盡上(shàng)清（如果培養基上(shàng)清去除不完全，将對細胞壁的酶解消化過程産生(shēng)抑制）。

注：E.coli菌株OD₆₀₀ =0.5 相(xiàng)當于1×10⁹個(gè)細菌。

1.2 菌體中加入100 μl酶溶液，渦旋震蕩20秒(miǎo)， 按照(zhào)下(xià)表處理。

注：不同細菌破壁難易程度不同，客戶根據細菌種類選擇合适的酶種類和破壁程序。

1.3 酶解後的菌體中加入500 μl裂解液RL（使用前請先檢查是否已加入β-巯基乙醇），混勻。

2. 離心得到(dào)上(shàng)清（可選步驟）：

若沒有不溶性沉澱，直接進行步驟3。如有不能(néng)裂解的碎片或者不溶物(wù)，13,000 rpm離心5 min, 取裂解物(wù)上(shàng)清進行下(xià)一(yī)步。

3. 去除基因組污染和洗脫RNA：

将DNA清除柱CS放(fàng)入一(yī)幹淨的2 ml離心管内，用移液器(qì)小(xiǎo)心将步驟2離心管内的溶液或離心後的上(shàng)清全部轉移到(dào)DNA清除柱CS中，13,000 rpm離心2分鍾（RNA在離心管濾液中，不要丢棄）。

注：确保全部溶液都收集到(dào)2 ml離心管中，如果膜上(shàng)有殘留液體，延長(cháng)離心時間至5分鍾，保證膜上(shàng)無殘留液體。

4. RNA挂柱：

  向2 ml離心管濾液中加入0.5倍體積的無水(shuǐ)乙醇（如濾液體積為(wèi)500 μl，加入250 μl無水(shuǐ)乙醇），此時可能(néng)會(huì)出現沉澱，立即混勻，不要離心。将全部溶液加入到(dào)RNA吸附柱CR中（吸附柱放(fàng)入收集管中），13,000 rpm離心1分鍾。

注：确保溶液全部過濾到(dào)收集管中，膜上(shàng)無殘留，如有必要，可以延長(cháng)離心時間至5分鍾。

5. 去除RNA中的蛋白(bái)污染：

向RNA吸附柱CR中（吸附柱放(fàng)入收集管中）加入500 μl 去蛋白(bái)液RD，13,000 rpm離心1分鍾，棄廢液。

6. 去除RNA中的其他雜(zá)質：

向RNA吸附柱CR中加入700 μl漂洗液RW（使用前請先檢查是否已加入乙醇）， 13,000 rpm離心1分鍾，棄廢液。

7. 進一(yī)步去除RNA中的其他雜(zá)質：

向吸附柱CR中加入500 μl漂洗液RW （使用前請先檢查是否已加入乙醇），13,000 rpm離心1

分鍾，棄廢液。

8.  關鍵步驟：徹底去除吸附柱上(shàng)的殘餘乙醇：

将吸附柱CR放(fàng)回收集管中，确保蓋好吸附柱管蓋，13,000 rpm将吸附柱CR空甩離心2 分鍾，去除吸附柱上(shàng)的殘餘液體。

注：此步驟目的是将吸附柱中殘餘漂洗液去除，如果有漂洗液殘留，可能(néng)會(huì)影響後續的RT等實驗操作。

9. 洗脫得到(dào)RNA：

将RNA吸附柱CR轉入一(yī)個(gè)新的1.5 ml RNase-free離心管中，向吸附柱O型墊圈中央懸空加入50-100 μl RNase-free水(shuǐ)（事(shì)先65℃預熱可提高(gāo)洗脫效率），蓋好吸附柱管蓋，常溫放(fàng)置2分鍾，13,000 rpm離心2 分鍾。

注：确保水(shuǐ)要加到(dào)膜的中央，不要貼壁加入；洗脫緩沖液體積不應少于50 μl，體積過小(xiǎo)影響回收效率。

10.  RNA貯存：

RNA樣品-80℃中保存。

● RNA産量和質量的評估：

1. RNA産量：

用分光(guāng)光(guāng)度計測定OD₂₆₀的吸光(guāng)值來計算(suàn)RNA産量。将RNA按照(zhào)一(yī)定的比例稀釋于TE溶液（10mMTris pH8.0，1mMEDTA）中，根據以下(xià)公式計算(suàn)：

A₂₆₀×稀釋倍數×40=μg RNA/ml

注：測定OD值時，盡量不要用RNase-free水(shuǐ)稀釋RNA，因為(wèi)RNase-free水(shuǐ)pH較低(dī)，測定的OD值偏低(dī)。

大腸杆菌DH5α RNA得率為(wèi)20-30μg/ml 菌液OD₆₀₀=0.5

2. RNA質量：

凝膠電(diàn)泳檢測：凝膠電(diàn)泳中，細菌的完整RNA應該有兩條主帶：26S和13S，并且26S亮度應該與13S相(xiàng)當或是其亮度的2倍。可以使用普通(tōng)的1×TAE瓊脂糖凝膠電(diàn)泳，凝膠濃度1-1.5 %，可以使用高(gāo)電(diàn)壓，短時間電(diàn)泳，如7V/cm電(diàn)泳，20分鍾。建議使用D2000 DNA ladder（Cat：RTM415）作為(wèi)Marker。細菌26S rRNA遷移率與800bp類似，13S rRNA遷移率與700bp類似。

吸光(guāng)值檢測：可以用A₂₃₀，A₂₆₀和A₂₈₀的數值表示RNA的純度。純淨的RNA的 A₂₆₀/A₂₈₀比值應該為(wèi)2，我們得到(dào)的RNA樣品比值應在1.8-2.2之間，如果比值低(dī)于1.8，表明RNA樣品中蛋白(bái)污染比較嚴重。A₂₆₀/A₂₃₀比值應該在2-2.2之間。如果此比值低(dī)于2，表明RNA樣品中有胍鹽的污染。

●  實驗示例:

● 問題指南(nán):

1. 離心柱發生(shēng)堵塞

離心柱發生(shēng)堵塞之後會(huì)造成 RNA 得率降低(dī)甚至不能(néng)純化得到(dào) RNA。

常見(jiàn)原因分析如下(xià)：

1.1細菌破碎不徹底。

細菌破碎不徹底會(huì)使吸附柱發生(shēng)堵塞，同時會(huì)影響 RNA 得率及質量。我們建議在進行細菌破壁時，盡量破碎細菌的細胞壁、細胞膜等組織。

1.2 樣本初始量過多(duō)。

樣本使用量過多(duō)會(huì)導緻裂解液RL plus裂解細胞時不完全，導緻離心柱堵塞。該試劑盒處理樣本的初始最大量10⁸-10⁹細菌細胞。

1.3 離心機(jī)的溫度過低(dī)。

整個(gè) RNA 分離純化所有的步驟均在常溫（20-25℃）進行。有些低(dī)溫離心機(jī)的溫度低(dī)于 20℃，可能(néng)會(huì)造成離心柱的堵塞。如果發生(shēng)這種現象，請将離心機(jī)溫度設置到(dào) 20-25℃。

2. 提取不到(dào)RNA或者RNA産量低(dī)

通(tōng)常會(huì)有多(duō)種因素影響回收效率，比如：樣本 RNA 含量、操作方法、洗脫體積等。

常見(jiàn)原因分析：

2.1  樣本保存不當或樣本保存時間過久導緻RNA 已經降解。

建議：新采集的樣本應立即放(fàng)入液氮中速凍，長(cháng)期保存于-70℃并避免樣本的反複凍融；或者将樣本立即浸泡在 RNA 穩定劑RNAwait溶液中。

2.2  樣本破碎裂解不充分導緻純化柱堵塞。

建議：溶菌酶破壁時，确保破壁完全。革蘭氏陽性菌注意破壁溫度和時間。

2.3  洗脫液添加不正确。

建議：确認 RNase-Free 水(shuǐ)滴加到(dào)了純化柱膜O型墊圈中央位置。

2.4  漂洗液RW中沒有添加正确體積的無水(shuǐ)乙醇。

建議：請按照(zhào)說明書，在試劑盒使用前，漂洗液RW中添加正确體積的無水(shuǐ)乙醇并混勻。

2.5  組織樣本用量不合适。

建議：每 500 μl 裂解液RL使用最大細菌量10⁹，使用過多(duō)會(huì)導緻 RNA 提取量降低(dī)并且得到(dào)的 RNA 純度也會(huì)降低(dī)。我們強烈建議每單次 RNA提取操作，樣本初始用量一(yī)定不要超過最大建議量。

2.6  洗脫體積不合适或洗脫不徹底。

建議：純化柱的洗脫液體積為(wèi) 50-100 μl；若洗脫效果并不理想，建議在加入65℃預熱的RNase-Free 水(shuǐ)後，延長(cháng)常溫放(fàng)置的時間，例如放(fàng)置 5-10 min。

2.7  純化柱在第二次RW洗滌之後有乙醇殘留。

建議：漂洗液RW洗滌後，吸附柱空甩離心2 min是關鍵步驟，以充分除去吸附柱上(shàng)殘留的乙醇。

3. 純化獲得的RNA有降解

純化得到(dào)的 RNA 的質量和樣本的保存、RNase 污染、操作等因素有關。

常見(jiàn)原因分析：

3.1  組織樣本采集後沒有及時保存。

建議：組織樣本在收集後若不及時使用，請立即低(dī)溫保存于液氮中或經液氮速凍後立即轉移至-70℃

長(cháng)期保存，或者将樣本立即浸泡在 RNA 穩定劑 RNAwait溶液中。提取 RNA 請盡量使用新近采取的組織樣本。

3.2  組織樣本反複凍融。

建議：組織樣本保存時，最好分裝成小(xiǎo)份，使用時取出其中一(yī)份即可，避免樣本的反複凍融導緻 RNA 的降解。

3.3  操作間有 RNase 引入或沒有佩戴一(yī)次性手套、口罩等。

建議：RNA 提取實驗最好在單獨的 RNA 操作間進行，并在實驗前清理好實驗桌，實驗時佩戴一(yī)次性手套、口罩，最大程度上(shàng)避免 RNase 引入導緻的RNA 降解。

3.4  試劑在使用過程中被 RNase 污染。

建議：更換新的植物(wù)總RNA 提取系列試劑盒進行相(xiàng)關實驗。

3.5  RNA 操作時所用的離心管、槍頭等有 RNase 污染。

建議：确認 RNA 提取時所用到(dào)的離心管、槍頭、移液器(qì)等都是 RNase-Free。

4. RNA中含有DNA污染

4.1 提取的起始菌體量超過最大建議量

建議：步驟1-樣品處理時使用10⁸-10⁹細菌，不要超過最大處理量，否則樣品的核酸量會(huì)超過DNA清除柱CS的處理極限，導緻洗脫下(xià)的RNA有基因組DNA的污染。

4.2  省略了步驟3-去除基因組污染步驟。

建議：步驟3-去除基因組污染步驟必不可少，不能(néng)省略。DNA清除柱CS能(néng)極大限度的去除上(shàng)清液中的基因組 DNA，使用裂解液RL plus洗脫下(xià)的RNA基本無基因組DNA的污染。

4.3  跳過了使用去蛋白(bái)液RD的漂洗步驟（見(jiàn)操作步驟第5步）。

建議：這一(yī)步驟對于除去殘留的 DNA 以及雜(zá)質蛋白(bái)十分重要，一(yī)定不能(néng)省略，否則将會(huì)導緻純化得到(dào)的 RNA 中含有DNA 污染和蛋白(bái)污染。

5. 純化獲得的RNA影響下(xià)遊實驗

經吸附柱純化的 RNA，如果鹽離子、蛋白(bái)質含量過多(duō)會(huì)影響下(xià)遊實驗，比如：逆轉錄、Northern Blot 等。

1.  洗脫後的 RNA 有鹽離子殘留。

建議：确認漂洗液RW中添加了正确體積的乙醇，并按操作說明的離心轉速進行2次RW洗滌吸附柱 （見(jiàn)操作步驟第6，7步）。

2.  洗脫後的 RNA 有乙醇殘留。

建議：确認 RW第二次洗滌後，按操作說明的對吸附柱進行空管離心操作（見(jiàn)操作步驟第8 步），如果還(hái)有乙醇殘留，可以将空管離心後吸附柱開(kāi)蓋常溫放(fàng)置 5 min，以最大程度上(shàng)去除乙醇殘留。