RealPure Animal Tissues/Cell RNA Extraction Kit

RealPure動物(wù)組織/細胞RNA提取試劑盒

● 試劑盒内容及保存：

● 儲存條件(jiàn)和效期：

RNase-free水(shuǐ)4℃貯存；其他試劑在常溫（25℃左右）幹燥條件(jiàn)下(xià)，可保存1年(nián)。試劑盒常溫運輸。

● 産品簡介：

本試劑盒可從(cóng)動物(wù)組織中快速提取總RNA， 可同時處理大量不同樣品。提取的總RNA純度高(gāo)，沒有蛋白(bái)和其它雜(zá)質的污染，可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、芯片分析、Northern Blot、Dot Blot、PolyA 篩選、體外翻譯、RNase 保護分析和分子克隆等多(duō)種下(xià)遊實驗。

● 準備工(gōng)作：

1操作前在裂解液RL中加入β-巯基乙醇至終濃度1%，如1 ml RL中加入10 μl β-巯基乙醇。此裂解液最好現用現配。配好的 RL4 ℃可放(fàng)置3天。

2 按照(zhào)标簽所示在漂洗液RW中加入無水(shuǐ)乙醇（自(zì)備），混勻後蓋緊瓶蓋後常溫貯存備用。

3 所有離心步驟均在常溫下(xià)進行。

● 操作步驟：

1. 樣品處理和裂解:

1.1 貼壁細胞：

1.1.1直接裂解法：

不需胰酶消化，徹底吸幹淨培養液體後直接加推薦量裂解液 RL（使用前請先檢查是否已加入β-巯基乙醇）（下(xià)表）反複吹打細胞裂解，可以漩渦震蕩，直到(dào)看(kàn)不到(dào)細胞團為(wèi)止，進行步驟2。

1.1. 2 胰蛋白(bái)酶消化法：

确定細胞數量（收集細胞數量請不要超過1×10⁷），吸除培養基，用PBS洗滌細胞，吸除PBS，向細胞中加入胰酶消化液處理細胞，當細胞脫離容器(qì)壁時，加入含有血清的培養基失活胰蛋白(bái)酶，将細胞溶液轉移至1.5 ml離心管中，300×g離心5 min，收集細胞沉澱，仔細吸除所有上(shàng)清，加 350 μl（<5x10⁶細胞）或 600 μl（5x10⁶-1x10⁷細胞）裂解液 RL（使用前請先檢查是否已加入β-巯基乙醇），反複吹打細胞裂解，可以漩渦震蕩，直到(dào)看(kàn)不到(dào)細胞團為(wèi)止，進行步驟2。

1.2 懸浮細胞：

300×g離心 5 min收集懸浮細胞（收集細胞數量請不要超過1×10⁷）到(dào)一(yī)個(gè)1.5ml 離心管中，完全吸棄上(shàng)清，加 350 μl（<5x10⁶細胞）或 600 μl（5x10⁶-1x10⁷細胞）裂解液 RL（使用前請先檢查是否已加入β-巯基乙醇），反複吹打細胞裂解，可以漩渦震蕩，直到(dào)看(kàn)不到(dào)細胞團為(wèi)止，進行步驟2。

   1.3 動物(wù)組織：

       新鮮組織加入350 μl(<20mg 組織)或者 600 μl(20-30mg 組織)的裂解液RL（使用前請先檢查是否已加入β-巯基乙醇）後玻璃勻漿器(qì)或電(diàn)動勻漿器(qì)将組織徹底研磨勻漿，進行步驟2。

注意：組織量一(yī)定不要超過30 mg，否則将導緻RNA得率和質量下(xià)降。

背景知識：樣品處理量絕對不要超過DNA/RNA吸附柱處理能(néng)力，否則造成DNA/RNA殘留或者産量降低(dī)。不同組織細胞種類DNA/RNA相(xiàng)差極大，例如胸腺脾髒DNA含量豐富，超過5 mg就(jiù)會(huì)超過柱子處理能(néng)力。COS細胞RNA含量豐富，超過3x10⁶細胞就(jiù)會(huì)超過柱子吸附能(néng)力。所以開(kāi)始摸索實驗條件(jiàn)時，如果不清楚樣品DNA/RNA含量時甯可使用較少的樣品處理量，如細胞不超過3-4x10⁶，組織不超過10mg，随後根據實驗結果增加或者減少處理量。

2. 離心得到(dào)上(shàng)清：

若沒有不溶性沉澱，直接進行步驟3。如有不能(néng)裂解的碎片或者不溶物(wù)，13,000 rpm離心5 min, 取裂解物(wù)上(shàng)清進行下(xià)一(yī)步。

3. 去除基因組污染和洗脫RNA：

将DNA清除柱CS放(fàng)入一(yī)幹淨的2 ml離心管内，用移液器(qì)小(xiǎo)心将步驟1離心管内的溶液或步驟2離心後的上(shàng)清全部轉移到(dào)DNA清除柱CS中，13,000 rpm離心2分鍾（RNA在離心管濾液中,不要丢棄）。

注：确保全部溶液都收集到(dào)2 ml離心管中，如果膜上(shàng)有殘留液體，延長(cháng)離心時間至5分鍾，保證膜上(shàng)無殘留液體。

4. RNA挂柱：

  向2 ml離心管濾液中加入0.5倍體積的無水(shuǐ)乙醇（如濾液體積為(wèi)300 μl/600 μl，加入150 μl/300 μl無水(shuǐ)乙醇），此時可能(néng)會(huì)出現沉澱，立即混勻，不要離心。将全部溶液加入到(dào)RNA吸附柱CR中（吸附柱放(fàng)入收集管中），13,000 rpm離心1分鍾。

注：确保溶液全部過濾到(dào)收集管中，膜上(shàng)無殘留，如有必要，可以延長(cháng)離心時間至5分鍾。

5. 去除RNA中的蛋白(bái)污染：

向RNA吸附柱CR中（吸附柱放(fàng)入收集管中）加入500 μl 去蛋白(bái)液RD，13,000 rpm離心1分鍾，棄廢液。

6. 去除RNA中的其他雜(zá)質：

向RNA吸附柱CR中加入700 μl漂洗液RW（使用前請先檢查是否已加入乙醇）， 13,000 rpm離心1分鍾，棄廢液。

7. 進一(yī)步去除RNA中的其他雜(zá)質：

向吸附柱CR中加入500 μl漂洗液RW （使用前請先檢查是否已加入乙醇），13,000 rpm離心1

分鍾，棄廢液。

8.  關鍵步驟：徹底去除吸附柱上(shàng)的殘餘乙醇：

将吸附柱CR放(fàng)回收集管中，确保蓋好吸附柱管蓋，13,000 rpm将吸附柱CR空甩離心2 分鍾，去除吸附柱上(shàng)的殘餘液體。

注：此步驟目的是将吸附柱中殘餘漂洗液去除，如果有漂洗液殘留，可能(néng)會(huì)影響後續的RT等實驗操作。

9. 洗脫得到(dào)RNA：

将RNA吸附柱CR轉入一(yī)個(gè)新的1.5 ml RNase-free離心管中，向吸附柱O型墊圈中央懸空加入50-100 μl RNase-free水(shuǐ)（事(shì)先65℃預熱可提高(gāo)洗脫效率），蓋好吸附柱管蓋，常溫放(fàng)置2分鍾，13,000 rpm離心2 分鍾。

注：确保水(shuǐ)要加到(dào)膜的中央，不要貼壁加入；洗脫緩沖液體積不應少于50 μl，體積過小(xiǎo)影響回收效率。

10.  RNA貯存：

RNA樣品-80℃中保存。

● RNA産量和質量的評估：

1. RNA産量：

用分光(guāng)光(guāng)度計測定OD₂₆₀的吸光(guāng)值來計算(suàn)RNA産量。将RNA按照(zhào)一(yī)定的比例稀釋于TE溶液（10mMTris pH8.0，1mMEDTA）中，根據以下(xià)公式計算(suàn)：

A₂₆₀×稀釋倍數×40=μg RNA/ml

注：測定OD值時，盡量不要用RNase-free水(shuǐ)稀釋RNA，因為(wèi)RNase-free水(shuǐ)pH較低(dī)，測定的OD值偏低(dī)。

2. RNA質量：

凝膠電(diàn)泳檢測：凝膠電(diàn)泳中，動物(wù)的完整RNA應該有兩條主帶：28S和18S，并且28S亮度應該與18S相(xiàng)當或是其亮度的2倍。可以使用普通(tōng)的1×TAE瓊脂糖凝膠電(diàn)泳，凝膠濃度1-1.5 %，可以使用高(gāo)電(diàn)壓，短時間電(diàn)泳，如7V/cm電(diàn)泳，20分鍾。建

議使用D2000 DNA ladder（Cat：RTM415）作為(wèi)Marker。28S rRNA遷移率與1800bp類似，18S rRNA遷移率與700bp類似。

吸光(guāng)值檢測：可以用A₂₃₀，A₂₆₀和A₂₈₀的數值表示RNA的純度。純淨的RNA的 A₂₆₀/A₂₈₀比值應該為(wèi)2，我們得到(dào)的RNA樣品比值應在1.8-2.2之間，如果比值低(dī)于1.8，表明RNA樣品中蛋白(bái)污染比較嚴重。A₂₆₀/A₂₃₀比值應該在2-2.2之間。如果此比值低(dī)于2，表明RNA樣品中有胍鹽的污染。

 ● 實驗示例:

                          1.2%瓊脂糖膠   1×TAE 150V 25min RealSafe Red預染

RNA提取試劑提取步驟：K562懸浮細胞，1 ml收集（6×10⁶/ml），PBS漂洗兩遍，加入1 ml RNA提取試劑，懸浮後常溫靜(jìng)置10分鍾，加入氯仿或氯仿替代物(wù)200 μl，徹底混勻後靜(jìng)置10分鍾，自(zì)然分相(xiàng)，4度 13000 rpm 離心15分鍾，上(shàng)清中加入等體積異丙醇，常溫靜(jìng)置20分鍾，4度 13000 rpm離心15分鍾，沉澱用1 ml 75%乙醇漂洗，4度 8000rpm 離心2分鍾，沉澱溶于50μl RNase-free水(shuǐ)中。

RTR2306操作簡述如下(xià)：K562懸浮細胞，1ml收集（6×10⁶/ml），PBS漂洗兩遍（平行做2管）。沉澱中加入350 μl 裂解液RL（已加β-ME），常溫裂解5分鍾，裂解物(wù)加到(dào)DNA清除柱CS中，離心收集到(dào)2 ml離心管中，離心管中加入0.5倍體積無水(shuǐ)乙醇，全部溶液加到(dào)RNA吸附柱CR中，離心，随後清除柱CS和RNA吸附柱CR一(yī)次RD漂洗，2次RW漂洗，最後每個(gè)吸附柱用50 μl RNase-free水(shuǐ)洗脫，合并兩管得到(dào)100 μl RNA和100 μl去除的基因組DNA。

● 問題指南(nán):

1. 離心柱發生(shēng)堵塞

離心柱發生(shēng)堵塞之後會(huì)造成 RNA 得率降低(dī)甚至不能(néng)純化得到(dào) RNA。

常見(jiàn)原因分析如下(xià)：

1.1組織或細胞破碎不徹底。

破碎不徹底會(huì)使吸附柱發生(shēng)堵塞，同時會(huì)影響 RNA 得率及質量。我們建議在進行裂解時，盡量借助輔助手段如機(jī)械勻漿徹底破碎組織。

1.2 樣本初始量過多(duō)。

樣本使用量過多(duō)會(huì)導緻裂解液RL裂解細胞時不完全，導緻離心柱堵塞。該試劑盒處理樣本的初

始最大量10⁷細胞或30 mg組織。

1.3 離心機(jī)的溫度過低(dī)。

整個(gè) RNA 分離純化所有的步驟均在常溫（20-25℃）進行。有些低(dī)溫離心機(jī)的溫度低(dī)于 20℃，可能(néng)會(huì)造成離心柱的堵塞。如果發生(shēng)這種現象，請将離心機(jī)溫度設置到(dào) 20-25℃。

2. 提取不到(dào)RNA或者RNA産量低(dī)

通(tōng)常會(huì)有多(duō)種因素影響回收效率，比如：樣本 RNA 含量、操作方法、洗脫體積等。

常見(jiàn)原因分析：

2.1  樣本保存不當或樣本保存時間過久導緻RNA 已經降解。

建議：新采集的樣本應立即放(fàng)入液氮中速凍，長(cháng)期保存于-70℃并避免樣本的反複凍融；或者将樣本立即浸泡在 RNA 穩定劑RNAwait溶液中。

2.2  樣本破碎裂解不充分導緻純化柱堵塞。

建議：參見(jiàn)1。

2.3  洗脫液添加不正确。

建議：确認 RNase-Free 水(shuǐ)滴加到(dào)了純化柱膜O型墊圈中央位置。

2.4  漂洗液RW中沒有添加正确體積的無水(shuǐ)乙醇。

建議：請按照(zhào)說明書，在試劑盒使用前，漂洗液RW中添加正确體積的無水(shuǐ)乙醇并混勻。

2.5  組織樣本用量不合适。

建議：每 600 μl 裂解液RL使用最大細胞量為(wèi)1×10⁷，使用最大組織量為(wèi)30 mg，過多(duō)會(huì)導緻 RNA 提取量降低(dī)并且得到(dào)的 RNA 純度也會(huì)降低(dī)。我們強烈建議每單次 RNA提取操作，樣本初始用量一(yī)定不要超過最大建議量。

2.6  洗脫體積不合适或洗脫不徹底。

建議：純化柱的洗脫液體積為(wèi) 50-100 μl；若洗脫效果并不理想，建議在加入65℃預熱的RNase-Free 水(shuǐ)後，延長(cháng)常溫放(fàng)置的時間，例如放(fàng)置 5-10 min。

2.7  純化柱在第二次RW洗滌之後有乙醇殘留。

建議：漂洗液RW洗滌後，吸附柱空甩離心2 min是關鍵步驟，以充分除去吸附柱上(shàng)殘留的乙醇。

3. 純化獲得的RNA有降解

純化得到(dào)的 RNA 的質量和樣本的保存、RNase 污染、操作等因素有關。

常見(jiàn)原因分析：

3.1  組織樣本采集後沒有及時保存。

建議：組織樣本在收集後若不及時使用，請立即低(dī)溫保存于液氮中或經液氮速凍後立即轉移至-70℃

長(cháng)期保存，或者将樣本立即浸泡在 RNA 穩定劑 RNAwait溶液中。提取 RNA 請盡量使用新近采取的組織樣本。

3.2  組織樣本反複凍融。

建議：組織樣本保存時，最好分裝成小(xiǎo)份，使用時取出其中一(yī)份即可，避免樣本的反複凍融導緻 RNA 的降解。

3.3  操作間有 RNase 引入或沒有佩戴一(yī)次性手套、口罩等。

建議：RNA 提取實驗最好在單獨的 RNA 操作間進行，并在實驗前清理好實驗桌，實驗時佩戴一(yī)次性手套、口罩，最大程度上(shàng)避免 RNase 引入導緻的RNA 降解。

3.4  試劑在使用過程中被 RNase 污染。

建議：更換新的提取試劑盒進行相(xiàng)關實驗。

3.5  RNA 操作時所用的離心管、槍頭等有 RNase 污染。

建議：确認 RNA 提取時所用到(dào)的離心管、槍頭、移液器(qì)等都是 RNase-Free。

4. RNA中含有DNA污染

4.1 提取的起始材料量超過最大建議量

建議：步驟1-樣品處理時使用10⁷細胞或30 mg組織，不要超過最大處理量，否則樣品的核酸量會(huì)超過DNA清除柱CS的處理極限，導緻洗脫下(xià)的RNA有基因組DNA的污染。

4.2  省略了步驟3-去除基因組污染步驟。

建議：步驟3-去除基因組污染步驟必不可少，不能(néng)省略。DNA清除柱CS能(néng)極大限度的去除上(shàng)清液中的基因組 DNA，使用裂解液RL洗脫下(xià)的RNA基本無基因組DNA的污染。

4.3  跳過了使用去蛋白(bái)液RD的漂洗步驟（見(jiàn)操作步驟第5步）。

建議：這一(yī)步驟對于除去殘留的 DNA 以及雜(zá)質蛋白(bái)十分重要，一(yī)定不能(néng)省略，否則将會(huì)導緻純化得到(dào)的 RNA 中含有DNA 污染和蛋白(bái)污染。

5. 純化獲得的RNA影響下(xià)遊實驗

經吸附柱純化的 RNA，如果鹽離子、蛋白(bái)質含量過多(duō)會(huì)影響下(xià)遊實驗，比如：逆轉錄、Northern Blot 等。

1.  洗脫後的 RNA 有鹽離子殘留。

建議：确認漂洗液RW中添加了正确體積的乙醇，并按操作說明的離心轉速進行2次RW洗滌吸附柱 （見(jiàn)操作步驟第6，7步）。

2.  洗脫後的 RNA 有乙醇殘留。