RealPure Plant RNA Extraction Kit

（for containing high polysaccharide and polyphenol components）

RealPure多(duō)糖多(duō)酚植物(wù)RNA提取試劑盒

● 試劑盒内容及保存：

● 儲存條件(jiàn)和效期：

RNase-free水(shuǐ)4℃保存；其他試劑在常溫（25℃左右）幹燥條件(jiàn)下(xià)，可保存1年(nián)。試劑盒常溫運輸。

● 産品簡介：

本試劑盒可從(cóng)植物(wù)葉片、莖、幼苗、果肉中快速提取總RNA，可同時處理大量不同樣品。試劑盒配套緩沖液PRS（Phenolic Remove Solution）可以去除植物(wù)中的多(duō)糖多(duō)酚對RNA提取的影響。20-30分鍾内即可完成反應，提取的總RNA純度高(gāo)，沒有DNA和蛋白(bái)的污染，可用于Northern blot、Dot blot、polyA 篩選、體外翻譯、RNase 保護分析和分子克隆等實驗。

該試劑盒不能(néng)有效提取植物(wù)種子、塊莖、鱗莖的RNA，提取這些材料的RNA請選擇RealPure植物(wù)種子RNA提取試劑盒（Cat：RTR2308）。

● 準備工(gōng)作：

1操作前在裂解液RL中加入β-巯基乙醇至終濃度1%，如500 μl RL中加入5 μl β-巯基乙醇。此裂解液最好現用現配。配好的 RL4 ℃可放(fàng)置3天。

2 按照(zhào)标簽所示在漂洗液RW中加入無水(shuǐ)乙醇（自(zì)備），混勻後蓋緊瓶蓋後室溫貯存備用。

3 所有離心步驟均在常溫下(xià)進行。

● 操作步驟：

1. 樣品處理:

1.1 1.5 ml離心管中加入500 μl裂解液RL（使用前請先檢查是否已加入β-巯基乙醇），50 μl緩沖液PRS混勻備用。

注：多(duō)糖多(duō)酚植物(wù)（如銀(yín)杏，毛白(bái)楊等）加入RL後，要加入緩沖液PRS，普通(tōng)植物(wù)（如拟南(nán)芥，小(xiǎo)麥，水(shuǐ)稻，煙(yān)草(cǎo)）可以不加緩沖液PRS。如果不能(néng)判斷植物(wù)是否為(wèi)多(duō)糖多(duō)酚植物(wù)，請加入緩沖液PRS。

注：快速判斷是否為(wèi)多(duō)糖多(duō)酚植物(wù)：

取20mg左右的植物(wù)材料，放(fàng)入1.5 ml離心管中，加入0.5 ml 0.2 M NaOH溶液，95℃ 10分鍾，觀察裂解物(wù)顔色。顔色為(wèi)綠色或淡黃色為(wèi)普通(tōng)植物(wù)；顔色為(wèi)棕黃色或棕紅(hóng)色為(wèi)多(duō)糖多(duō)酚植物(wù)。

1.2将植物(wù)材料加入到(dào)液氮預冷的研缽中，用研杵研磨，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀。取50 mg粉末迅速加入到(dào)離心管中，渦旋劇烈震蕩混勻，常溫放(fàng)置5分鍾。

注：一(yī)定不要加入超過50 mg的粉末，否則樣品超過裂解液RL的裂解能(néng)力會(huì)導緻RNA提取失敗。

背景知識：樣品處理量絕對不要超過RNA吸附柱處理能(néng)力，否則造成RNA殘留或者産量降低(dī)。不同植物(wù)組織RNA相(xiàng)差極大，例如某些植物(wù)種子如綠豆RNA含量豐富，超過50 mg就(jiù)會(huì)超過柱子處理能(néng)力。所以開(kāi)始摸索實驗條件(jiàn)時，如果不清楚樣品RNA含量時甯可使用較少的樣品處理量，如植物(wù)葉片或植物(wù)種子裂解溶液中都不要超過50 mg，随後根據實驗結果增加或者減少處理量。

2. 離心取上(shàng)清：

13,000 rpm離心5 min，小(xiǎo)心吸取收集管中的上(shàng)清至1.5 ml RNase-free的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細胞碎片沉澱。一(yī)般可獲得400 μl上(shàng)清。

3. 去除基因組污染：

上(shàng)清中加入0.5倍體積的無水(shuǐ)乙醇（如400 μl上(shàng)清中加入200 μl無水(shuǐ)乙醇），混勻（此時可能(néng)會(huì)出現沉澱），得到(dào)的溶液和沉澱一(yī)起轉入DNA清除柱CS（清除柱放(fàng)入收集管中）中，13,000 rpm離心2分鍾，棄掉收集管中的廢液。

注：确保全部溶液都收集到(dào)收集管中，如果膜上(shàng)有殘留液體，延長(cháng)離心時間至5分鍾，保證膜上(shàng)無殘留液體。

4. 洗脫RNA：

  将DNA清除柱放(fàng)入一(yī)幹淨的2 ml離心管中，在清除柱中加入500 μl 裂解液RL plus，13,000 rpm離心1分鍾，收集濾液（注意：RNA在濾液中，不要丢棄），濾液中加入250 μl無水(shuǐ)乙醇，此時可能(néng)會(huì)出現沉澱，立即混勻，不要離心。

5. RNA挂柱：

  将全部溶液加入到(dào)RNA吸附柱CR中（吸附柱放(fàng)入收集管中），13,000 rpm離心2分鍾。

注：确保溶液全部過濾到(dào)收集管中，膜上(shàng)無殘留，如有必要，可以延長(cháng)離心時間至5分鍾。

6. 去除RNA中的蛋白(bái)污染：

向RNA吸附柱CR中（吸附柱放(fàng)入收集管中）加入500 μl 去蛋白(bái)液RD，13,000 rpm離心1分鍾，棄廢液。

7. 去除RNA中的其他雜(zá)質：

向RNA吸附柱CR中加入700 μl漂洗液RW（使用前請先檢查是否已加入乙醇）， 13,000 rpm離心1分鍾，棄廢液。

8. 進一(yī)步去除RNA中的其他雜(zá)質：

向吸附柱CR中加入500 μl漂洗液RW （使用前請先檢查是否已加入乙醇），13,000 rpm離心1

分鍾，棄廢液，将吸附柱CR放(fàng)回收集管中，确保蓋好吸附柱管蓋。

9.  關鍵步驟：徹底去除吸附柱上(shàng)的殘餘乙醇：

13,000 rpm将吸附柱CR空甩離心2 分鍾，去除吸附柱上(shàng)的殘餘液體。

注：此步驟目的是将吸附柱中殘餘的漂洗液去除，如果有漂洗液殘留，可能(néng)會(huì)影響後續的RT等實驗操作。

10. 洗脫得到(dào)RNA：

将RNA吸附柱CR轉入一(yī)個(gè)新的1.5 ml RNase-free離心管中，向吸附柱O型墊圈中央懸空加入50-100 μl RNase-free水(shuǐ)（事(shì)先65℃預熱可提高(gāo)洗脫效率），蓋好吸附柱管蓋，常溫放(fàng)置2分鍾，13,000 rpm離心2 分鍾。

注：确保水(shuǐ)要加到(dào)膜的中央,不要貼壁加入;洗脫緩沖液體積不應少于50 μl,體積過小(xiǎo)影響回收效率。

11. RNA貯存：

RNA樣品-80℃中保存。

● RNA産量和質量的評估：

1. RNA産量：

用分光(guāng)光(guāng)度計測定OD₂₆₀的吸光(guāng)值來計算(suàn)RNA産量。将RNA按照(zhào)一(yī)定的比例稀釋于TE溶液（10mMTris pH8.0，1mMEDTA）中，根據以下(xià)公式計算(suàn)：

A₂₆₀×稀釋倍數×40=μg RNA/ml

注：測定OD值時，盡量不要用RNase-free水(shuǐ)稀釋RNA，因為(wèi)RNase-free水(shuǐ)pH較低(dī)，測定的OD值偏低(dī)。

2. RNA質量：

凝膠電(diàn)泳檢測：凝膠電(diàn)泳中，完整的RNA應該有兩條主帶：28S和18S，并且28S亮度應該與18S相(xiàng)當或是其亮度的2倍。可以使用普通(tōng)的1×TAE瓊脂糖凝膠電(diàn)泳，凝膠濃度1-1.5 %，可以使用高(gāo)電(diàn)壓，短時間電(diàn)泳，如7V/cm電(diàn)泳，20分鍾。建議使用D2000 DNA ladder（Cat：RTM415）作為(wèi)Marker。植物(wù)28S rRNA遷移率與1500bp類似，18S rRNA遷移率與1000bp類似。

● 問題指南(nán):

1. 離心柱發生(shēng)堵塞       

離心柱發生(shēng)堵塞之後會(huì)造成 RNA 得率降低(dī)甚至不能(néng)純化得到(dào) RNA。

常見(jiàn)原因分析如下(xià)：

1.1：樣本破碎不徹底。

樣本破碎不徹底會(huì)使吸附柱發生(shēng)堵塞，同時會(huì)影響 RNA 得率及質量。我們建議在進行樣本破碎的時候，在足量的液氮中快速研磨操作，盡量破碎樣本細胞壁、細胞膜等組織。

1.2 樣本初始量過多(duō)。

樣本使用量過多(duō)會(huì)導緻裂解液RL或裂解液RSL裂解細胞時不完全，導緻離心柱堵塞。RealPure多(duō)糖多(duō)酚植物(wù)RNA提取試劑盒和RealPure植物(wù)種子RNA提取試劑盒處理樣本的初始最大量為(wèi)50 mg。

1.3 離心機(jī)的溫度過低(dī)。

整個(gè) RNA 分離純化除了液氮破碎樣本組織外，所有的步驟均在常溫（20-25℃）進行。有些低(dī)溫離心機(jī)的溫度低(dī)于 20℃，可能(néng)會(huì)造成離心柱的堵塞。如果發生(shēng)這種現象，請将離心機(jī)溫度設置到(dào) 20-25℃。

2. 提取不到(dào)RNA或者RNA産量低(dī)

通(tōng)常會(huì)有多(duō)種因素影響回收效率，比如：樣本 RNA 含量、操作方法、洗脫體積等。

常見(jiàn)原因分析：

2.1  樣本保存不當或樣本保存時間過久導緻RNA 已經降解。

建議：新采集的樣本應立即放(fàng)入液氮中速凍，長(cháng)期保存于-70℃并避免樣本的反複凍融；或者将樣本立即浸泡在 RNA 穩定劑RNAwait溶液中。

2.2  樣本破碎裂解不充分導緻純化柱堵塞。

建議：在組織研磨時，請保證組織充分研磨，并在研磨完成後迅速轉移至預先準備好的裂解液RL或裂解液RSL（确認已添加正确比例的 β-ME）中。

2.3  洗脫液添加不正确。

建議：确認 RNase-Free 水(shuǐ)滴加到(dào)了純化柱膜O型墊圈中央位置。

2.4  漂洗液RW中沒有添加正确體積的無水(shuǐ)乙醇。

建議：請按照(zhào)說明書，在試劑盒使用前，漂洗液RW中添加正确體積的無水(shuǐ)乙醇并混勻。

2.5  組織樣本用量不合适。

建議：每 500 μl 裂解液RL或裂解液 RSL使用最大組織量50 mg，組織使用過多(duō)會(huì)導緻 RNA 提取量降低(dī)并且得到(dào)的 RNA 純度也會(huì)降低(dī)。我們強烈建議每單次 RNA提取操作，樣本初始用量一(yī)定不要超過最大建議量。

2.6  洗脫體積不合适或洗脫不徹底。

建議：純化柱的洗脫液體積為(wèi) 50-100 μl；若洗脫效果并不理想，建議在加入65℃預熱的RNase-Free 水(shuǐ)後，延長(cháng)常溫放(fàng)置的時間，例如放(fàng)置 5-10 min。

2.7  純化柱在第二次RW洗滌之後有乙醇殘留。

建議：漂洗液RW洗滌後，吸附柱空甩離心2 min是關鍵步驟，以充分除去吸附柱上(shàng)殘留的乙醇。

2.8  試劑盒使用不正确。

建議：對于多(duō)酚多(duō)糖的植物(wù)樣本，務必使用緩沖液PRS，這是我們專門(mén)針對多(duō)酚多(duō)糖植物(wù)樣本而研制的多(duō)糖多(duō)酚去除劑，如不添加，将導緻RNA不能(néng)挂柱或提取到(dào)純度不高(gāo)的RNA。

3. 純化獲得的RNA有降解

純化得到(dào)的 RNA 的質量和樣本的保存、RNase 污染、操作等因素有關。 常見(jiàn)原因分析：

3.1  組織樣本采集後沒有及時保存。

建議：組織樣本在收集後若不及時使用，請立即低(dī)溫保存于液氮中或經液氮速凍後立即轉移至-70℃長(cháng)期保存，或者将樣本立即浸泡在 RNA 穩定劑 RNAwait溶液中。提取 RNA 請盡量使用新近采取的組織樣本。

3.2  組織樣本反複凍融。

建議：組織樣本保存時，最好剪成小(xiǎo)段保存，使用時取出其中一(yī)部分即可，避免樣本的反複凍融導緻 RNA 的降解。

3.3  操作間有 RNase 引入或沒有佩戴一(yī)次性手套、口罩等。

建議：RNA 提取實驗最好在單獨的 RNA 操作間進行，并在實驗前清理好實驗桌，實驗時佩戴一(yī)次性手套、口罩，最大程度上(shàng)避免 RNase 引入導緻的RNA 降解。

3.4  試劑在使用過程中被 RNase 污染。

建議：更換新的植物(wù)總RNA 提取系列試劑盒進行相(xiàng)關實驗。

3.5  RNA 操作時所用的離心管、槍頭等有 RNase 污染。

建議：确認 RNA 提取時所用到(dào)的離心管、槍頭、移液器(qì)等都是 RNase-Free。

4. RNA中含有DNA污染

4.1 提取的起始材料超過50 mg

建議：步驟1-樣品處理時用天平稱取粉末重量，不要超過50 mg，否則樣品的核酸量會(huì)超過DNA清除柱CS的處理極限，導緻洗脫下(xià)的RNA有基因組DNA的污染。

4.2  省略了步驟3-去除基因組污染步驟。

建議：步驟3-去除基因組污染步驟必不可少，不能(néng)省略。DNA清除柱CS能(néng)極大限度的去除上(shàng)清液中的基因組 DNA，使用裂解液RL plus洗脫下(xià)的RNA基本無基因組DNA的污染。

4.3  跳過了使用去蛋白(bái)液RD的漂洗步驟（見(jiàn)操作步驟第6步）。

建議：這一(yī)步驟對于除去殘留的 DNA 以及雜(zá)質蛋白(bái)十分重要，一(yī)定不能(néng)省略，否則将會(huì)導緻純化得到(dào)的 RNA 中含有DNA 污染和蛋白(bái)污染。

5. 純化獲得的RNA影響下(xià)遊實驗

經吸附柱純化的 RNA，如果鹽離子、蛋白(bái)質含量過多(duō)會(huì)影響下(xià)遊實驗，比如：逆轉錄、Northern Blot 等。

1.  洗脫後的 RNA 有鹽離子殘留。

建議：确認漂洗液RW中添加了正确體積的乙醇，并按操作說明的離心轉速進行2次RW洗滌吸附柱 （見(jiàn)操作步驟第7，8步）。

2.  洗脫後的 RNA 有乙醇殘留。

建議：确認 RW第二次洗滌後，按操作說明的對吸附柱進行空管離心操作（見(jiàn)操作步驟第9 步），如果還(hái)有乙醇殘留，可以将空管離心後吸附柱開(kāi)蓋常溫放(fàng)置 5 min，以最大程度上(shàng)去除乙醇殘留。

實驗示例：