您好,歡迎光(guāng)臨中科瑞泰!

免費(fèi)咨詢電(diàn)話:
400-699-0631

首頁 > 核酸生(shēng)物(wù)學 > 核酸提取 > RNA提取

RealPure普通(tōng)植物(wù)RNA提取試劑盒

RealPure普通(tōng)植物(wù)RNA提取試劑盒

産品編号:RTR2302

産品規格:50次

數量
價格 ¥500

RealPure普通(tōng)植物(wù)RNA提取試劑盒

RealPure Plant RNA Extraction Kit for Conventional Plants

貨号

名稱

規格

RTR2302

RealPure普通(tōng)植物(wù)RNA提取試劑盒

50

試劑盒内容及保存:

試劑盒組成

RTR2302-01 50次)

貯存

裂解液RL

30 ml

常溫

裂解液RL plus

30 ml

常溫

去蛋白(bái)液RD

30 ml

常溫

漂洗液RW(濃縮液)

25 ml

首次使用按照(zhào)标簽加入無水(shuǐ)乙醇

常溫

RNase-free水(shuǐ)

5 ml

4

DNA清除柱CSRNase-free

50個(gè)

常溫

RNA吸附柱CRRNase-free

50個(gè)

常溫

收集管

100個(gè)

常溫

2 ml離心管(RNase-free

50個(gè)

常溫

1.5 ml離心管(RNase-free

150個(gè)

常溫

說明書

1

 

儲存條件(jiàn)和效期:

RNase-free水(shuǐ)4℃保存;其他試劑在常溫(25℃左右)幹燥條件(jiàn)下(xià),可保存1年(nián)。試劑盒常溫運輸。

産品簡介:

本試劑盒可從(cóng)普通(tōng)植物(wù)(拟南(nán)芥,水(shuǐ)稻,小(xiǎo)麥,煙(yān)草(cǎo),玉米,綠蘿等)葉片、莖、幼苗、果肉中快速提取總RNA,可同時處理大量不同樣品,20-30分鍾内即可完成反應,提取的總RNA純度高(gāo),沒有DNA和蛋白(bái)的污染,可用于Northern blot、Dot blot、polyA 篩選、體外翻譯、RNase 保護分析和分子克隆等實驗。

由于植物(wù)材料的複雜(zá)性,該試劑盒不能(néng)提取多(duō)糖多(duō)酚植物(wù)RNA,也不能(néng)有效提取植物(wù)種子、塊莖、鱗莖的RNA,提取這些材料的RNA請選擇RealPure多(duō)糖多(duō)酚植物(wù)RNA提取試劑盒(Cat:RTR2304)和RealPure植物(wù)種子RNA提取試劑盒(Cat:RTR2308)。

準備工(gōng)作:

1操作前在裂解液RL中加入β-巯基乙醇至終濃度1%,如500 μl RL中加入5 μl β-巯基乙醇。此裂解液最好現用現配。配好的 RL4 ℃可放(fàng)置3天。

2 按照(zhào)标簽所示在漂洗液RW中加入無水(shuǐ)乙醇(自(zì)備),混勻後蓋緊瓶蓋後室溫貯存備用。

3 所有離心步驟均在常溫下(xià)進行。

操作步驟:

1. 樣品處理:

1.1 1.5 ml離心管中加入500 μl裂解液RL(使用前請先檢查是否已加入β-巯基乙醇)。

注:多(duō)糖多(duō)酚植物(wù)(如銀(yín)杏,毛白(bái)楊等)使用該試劑盒不能(néng)提取RNA,請選擇RealPure多(duō)糖多(duō)酚植物(wù)RNA提取試劑盒(Cat:RTR2304)。

背景知識:快速判斷是否為(wèi)多(duō)糖多(duō)酚植物(wù)

取20mg左右的植物(wù)材料,放(fàng)入1.5 ml離心管中,加入0.5 ml 0.2 M NaOH溶液,95℃ 10分鍾,觀察裂解物(wù)顔色。顔色為(wèi)綠色或淡黃色為(wèi)普通(tōng)植物(wù);顔色為(wèi)棕黃色或棕紅(hóng)色為(wèi)多(duō)糖多(duō)酚植物(wù)。

1.2将植物(wù)材料加入到(dào)液氮預冷的研缽中,用研杵研磨,其間不斷加入液氮,直至研磨成粉末狀。取50 mg粉末迅速加入到(dào)離心管中,渦旋劇烈震蕩混勻,常溫放(fàng)置5分鍾。

注:一(yī)定不要加入超過50 mg的粉末,否則樣品超過裂解液RL的裂解能(néng)力會(huì)導緻RNA提取失敗。

背景知識:樣品處理量絕對不要超過RNA吸附柱處理能(néng)力,否則造成RNA殘留或者産量降低(dī)。不同植物(wù)組織種類RNA相(xiàng)差極大,例如有些植物(wù)種子RNA含量較高(gāo),玉米種子RNA含量可達50 μg/50 mg種子,超過50 mg材料會(huì)超過吸附柱吸附能(néng)力,導緻提取失敗。所以開(kāi)始摸索實驗條件(jiàn)時,如果不清楚樣品RNA含量時甯可使用較少的樣品處理量,如植物(wù)組織不超過50 mg,随後根據實驗結果增加或者減少處理量。

2. 離心取上(shàng)清:

13,000 rpm離心5 min,小(xiǎo)心吸取收集管中的上(shàng)清至1.5 ml RNase-free的離心管中,吸頭盡量避免接觸收集管中的細胞碎片沉澱。一(yī)般可獲得400 μl上(shàng)清。

3. 去除基因組污染:

上(shàng)清中加入0.5倍體積的無水(shuǐ)乙醇(如400 μl上(shàng)清中加入200 μl無水(shuǐ)乙醇),混勻(此時可能(néng)會(huì)出現沉澱),得到(dào)的溶液和沉澱一(yī)起轉入DNA清除柱CS(清除柱放(fàng)入收集管中)中,13,000 rpm離心2分鍾,棄掉收集管中的廢液。

注:确保全部溶液都收集到(dào)收集管中,如果膜上(shàng)有殘留液體,延長(cháng)離心時間至5分鍾,保證膜上(shàng)無殘留液體。

4. 洗脫RNA

  将DNA清除柱放(fàng)入一(yī)幹淨的2 ml離心管中,在清除柱中加入500 μl 裂解液RL plus,13,000 rpm離心1分鍾,收集濾液(注意:RNA在濾液中,不要丢棄),濾液中加入250 μl無水(shuǐ)乙醇,此時可能(néng)會(huì)出現沉澱,立即混勻,不要離心。

5. RNA挂柱:

  将全部溶液加入到(dào)RNA吸附柱CR中(吸附柱放(fàng)入收集管中),13,000 rpm離心2分鍾。

注:确保溶液全部過濾到(dào)收集管中,膜上(shàng)無殘留,如有必要,可以延長(cháng)離心時間至5分鍾。

6. 去除RNA中的蛋白(bái)污染:

向RNA吸附柱CR中(吸附柱放(fàng)入收集管中)加入500 μl 去蛋白(bái)液RD,13,000 rpm離心1分鍾,棄廢液。

7. 去除RNA中的其他雜(zá)質:

向RNA吸附柱CR中加入700 μl漂洗液RW(使用前請先檢查是否已加入乙醇), 13,000 rpm離心1分鍾,棄廢液。

8. 進一(yī)步去除RNA中的其他雜(zá)質:

向吸附柱CR中加入500 μl漂洗液RW (使用前請先檢查是否已加入乙醇),13,000 rpm離心1

分鍾,棄廢液,将吸附柱CR放(fàng)回收集管中,确保蓋好吸附柱管蓋。

9.  關鍵步驟:徹底去除吸附柱上(shàng)的殘餘乙醇:

13,000 rpm将吸附柱CR空甩離心2 分鍾,去除吸附柱上(shàng)的殘餘液體。

注:此步驟目的是将吸附柱中殘餘的漂洗液去除,如果有漂洗液殘留,可能(néng)會(huì)影響後續的RT等實驗操作。

10. 洗脫得到(dào)RNA

将RNA吸附柱CR轉入一(yī)個(gè)新的1.5 ml RNase-free離心管中,向吸附柱O型墊圈中央懸空加入50-100 μl RNase-free水(shuǐ)(事(shì)先65℃預熱可提高(gāo)洗脫效率),蓋好吸附柱管蓋,常溫放(fàng)置2分鍾,13,000 rpm離心2 分鍾。

注:确保水(shuǐ)要加到(dào)膜的中央,不要貼壁加入;洗脫緩沖液體積不應少于50 μl,體積過小(xiǎo)影響回收效率。

11. RNA貯存:

RNA樣品-80℃中保存。

RNA産量和質量的評估:

1. RNA産量:

用分光(guāng)光(guāng)度計測定OD260的吸光(guāng)值來計算(suàn)RNA産量。将RNA按照(zhào)一(yī)定的比例稀釋于TE溶液(10mMTris pH8.0,1mMEDTA)中,根據以下(xià)公式計算(suàn):

A260×稀釋倍數×40=μg RNA/ml

注:測定OD值時,盡量不要用RNase-free水(shuǐ)稀釋RNA,因為(wèi)RNase-free水(shuǐ)pH較低(dī),測定的OD值偏低(dī)。

2. RNA質量:

凝膠電(diàn)泳檢測:凝膠電(diàn)泳中,完整的RNA應該有兩條主帶:28S和18S,并且28S亮度應該與18S相(xiàng)當或是其亮度的2倍。可以使用普通(tōng)的1×TAE瓊脂糖凝膠電(diàn)泳,凝膠濃度1-1.5 %,可以使用高(gāo)電(diàn)壓,短時間電(diàn)泳,如7V/cm電(diàn)泳,20分鍾。建議使用D2000 DNA ladder(Cat:RTM415)作為(wèi)Marker。植物(wù)28S rRNA遷移率與1500bp類似,18S rRNA遷移率與1000bp類似。

吸光(guāng)值檢測:可以用A230,A260和A280的數值表示RNA的純度。純淨的RNA的 A260/A280比值應該為(wèi)2,我們得到(dào)的RNA樣品比值應在1.8-2.2之間,如果比值低(dī)于1.8,表明RNA樣品中蛋白(bái)污染比較嚴重。A260/A230比值應該在2-2.2之間。如果此比值低(dī)于2,表明RNA樣品中有胍鹽,多(duō)糖的污染。

●  實驗示例:

 

綠蘿葉片RNA

13 使用了DNA清除柱

24未使用DNA清除柱

1% 瓊脂糖凝膠 1×TAE 150V 20min

 ●  問題指南(nán):

1. 離心柱發生(shēng)堵塞

離心柱發生(shēng)堵塞之後會(huì)造成 RNA 得率降低(dī)甚至不能(néng)純化得到(dào) RNA。

常見(jiàn)原因分析如下(xià):

1.1:樣本破碎不徹底。

樣本破碎不徹底會(huì)使吸附柱發生(shēng)堵塞,同時會(huì)影響 RNA 得率及質量。我們建議在進行樣本破碎的時候,在足量的液氮中快速研磨操作,盡量破碎樣本細胞壁、細胞膜等組織。

1.2 樣本初始量過多(duō)。

樣本使用量過多(duō)會(huì)導緻裂解液RL或裂解液RSL裂解細胞時不完全,導緻離心柱堵塞。RealPure植物(wù)RNA提取試劑盒處理樣本的初始最大量為(wèi)50 mg。

1.3 離心機(jī)的溫度過低(dī)。

整個(gè) RNA 分離純化除了液氮破碎樣本組織外,所有的步驟均在常溫(20-25)進行。有些低(dī)溫離心機(jī)的溫度低(dī)于 20,可能(néng)會(huì)造成離心柱的堵塞。如果發生(shēng)這種現象,請将離心機(jī)溫度設置到(dào) 20-25

2. 提取不到(dào)RNA或者RNA産量低(dī)

通(tōng)常會(huì)有多(duō)種因素影響回收效率,比如:樣本 RNA 含量、操作方法、洗脫體積等。

常見(jiàn)原因分析:

2.1  樣本保存不當或樣本保存時間過久導緻RNA 已經降解。

建議:新采集的樣本應立即放(fàng)入液氮中速凍,長(cháng)期保存于-70并避免樣本的反複凍融;或者将樣本立即浸泡在 RNA 穩定劑RNAwait溶液中。

2.2  樣本破碎裂解不充分導緻純化柱堵塞。

建議:在組織研磨時,請保證組織充分研磨,并在研磨完成後迅速轉移至預先準備好的裂解液RL或裂解液RSL(确認已添加正确比例的 β-ME)中。

2.3  洗脫液添加不正确。

建議:确認 RNase-Free 水(shuǐ)滴加到(dào)了純化柱膜O型墊圈中央位置。

2.4  漂洗液RW中沒有添加正确體積的無水(shuǐ)乙醇。

建議:請按照(zhào)說明書,在試劑盒使用前,漂洗液RW中添加正确體積的無水(shuǐ)乙醇并混勻。

2.5  組織樣本用量不合适。

建議:每 500 μl 裂解液RL或裂解液 RSL使用最大組織量50 mg,組織使用過多(duō)會(huì)導緻 RNA 提取量降低(dī)并且得到(dào)的 RNA 純度也會(huì)降低(dī)。我們強烈建議每單次 RNA提取操作,樣本初始用量一(yī)定不要超過最大建議量。

2.6  洗脫體積不合适或洗脫不徹底。

建議:純化柱的洗脫液體積為(wèi) 50-100 μl;若洗脫效果并不理想,建議在加入65預熱的RNase-Free 水(shuǐ)後,延長(cháng)常溫放(fàng)置的時間,例如放(fàng)置 5-10 min。

2.7  純化柱在第二次RW洗滌之後有乙醇殘留。

建議:漂洗液RW洗滌後,吸附柱空甩離心2 min是關鍵步驟,以充分除去吸附柱上(shàng)殘留的乙醇。

2.8  試劑盒使用不正确。

建議:對于多(duō)酚多(duō)糖的植物(wù)樣本,務必使用緩沖液PRS,這是我們專門(mén)針對多(duō)酚多(duō)糖植物(wù)樣本而研制的多(duō)糖多(duō)酚去除劑,如不添加,将導緻RNA不能(néng)挂柱或提取到(dào)純度不高(gāo)的RNA。

3. 純化獲得的RNA有降解

純化得到(dào)的 RNA 的質量和樣本的保存、RNase 污染、操作等因素有關。

常見(jiàn)原因分析:

3.1  組織樣本采集後沒有及時保存。

建議:組織樣本在收集後若不及時使用,請立即低(dī)溫保存于液氮中或經液氮速凍後立即轉移至-70長(cháng)期保存,或者将樣本立即浸泡在 RNA 穩定劑 RNAwait溶液中。提取 RNA 請盡量使用新近采取的組織樣本。

3.2  組織樣本反複凍融。

建議:組織樣本保存時,最好剪成小(xiǎo)段保存,使用時取出其中一(yī)部分即可,避免樣本的反複凍融導緻 RNA 的降解。

3.3  操作間有 RNase 引入或沒有佩戴一(yī)次性手套、口罩等。

建議:RNA 提取實驗最好在單獨的 RNA 操作間進行,并在實驗前清理好實驗桌,實驗時佩戴一(yī)次性手套、口罩,最大程度上(shàng)避免 RNase 引入導緻的RNA 降解。

3.4  試劑在使用過程中被 RNase 污染。

建議:更換新的植物(wù)總RNA 提取系列試劑盒進行相(xiàng)關實驗。

3.5  RNA 操作時所用的離心管、槍頭等有 RNase 污染。

建議:确認 RNA 提取時所用到(dào)的離心管、槍頭、移液器(qì)等都是 RNase-Free。

4. RNA中含有DNA污染

4.1 提取的起始材料超過50 mg

建議:步驟1-樣品處理時用天平稱取粉末重量,不要超過50 mg,否則樣品的核酸量會(huì)超過DNA清除柱CS的處理極限,導緻洗脫下(xià)的RNA有基因組DNA的污染。

4.2  省略了步驟3-去除基因組污染步驟。

建議:步驟3-去除基因組污染步驟必不可少,不能(néng)省略。DNA清除柱CS能(néng)極大限度的去除上(shàng)清液中的基因組 DNA,使用裂解液RL plus洗脫下(xià)的RNA基本無基因組DNA的污染。

4.3  跳過了使用去蛋白(bái)液RD的漂洗步驟(見(jiàn)操作步驟第6步)。

建議:這一(yī)步驟對于除去殘留的 DNA 以及雜(zá)質蛋白(bái)十分重要,一(yī)定不能(néng)省略,否則将會(huì)導緻純化得到(dào)的 RNA 中含有DNA 污染和蛋白(bái)污染。

5. 純化獲得的RNA影響下(xià)遊實驗

經吸附柱純化的 RNA,如果鹽離子、蛋白(bái)質含量過多(duō)會(huì)影響下(xià)遊實驗,比如:逆轉錄、Northern Blot 等。

1.  洗脫後的 RNA 有鹽離子殘留。

建議:确認漂洗液RW中添加了正确體積的乙醇,并按操作說明的離心轉速進行2次RW洗滌吸附柱 (見(jiàn)操作步驟第7,8步)。

2.  洗脫後的 RNA 有乙醇殘留。

建議:确認 RW第二次洗滌後,按操作說明的對吸附柱進行空管離心操作(見(jiàn)操作步驟第9 步),如果還(hái)有乙醇殘留,可以将空管離心後吸附柱開(kāi)蓋常溫放(fàng)置 5 min,以最大程度上(shàng)去除乙醇殘留。

 


 
隻有購買過該商品的用戶才能(néng)進行評價。[發表評價]