RNA提取試劑（目錄号：RTR2301）

● 試劑内容：

● 儲存、運輸及效期：

2-8℃避光(guāng)保存；常溫運輸；有效期1年(nián)。

● 産品簡介：

RNA提取試劑是從(cóng)細胞和組織中提取總RNA的即用型試劑，可以提取細菌、植物(wù)、動物(wù)組織和細胞以及新鮮血液的總RNA。提取的總RNA可用于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase保護分析等分子生(shēng)物(wù)學實驗。

● 産品特點：

1 分相(xiàng)明顯：本試劑為(wèi)粉紅(hóng)色，便于氯仿分相(xiàng)後區分水(shuǐ)相(xiàng)和有機(jī)相(xiàng)。

2 結果可靠：該試劑含有強烈抑制RNase活性的物(wù)質，可靠保護RNA不降解。

3 價廉物(wù)美：其提取效果與國(guó)外進口産品相(xiàng)媲美，價格卻低(dī)于它的三分之一(yī)。

● 操作步驟：

實驗前需要準備的試劑和耗材：

氯仿、異丙醇、75%乙醇（用RNase-free水(shuǐ)配制）、RNase-free的水(shuǐ)、RNase-free的耗材（Tip頭，離心管等）。

1. 勻漿處理（Homogenization）

1.1組織中提取總RNA：

1.1.1植物(wù)組織：植物(wù)葉片直接放(fàng)入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100mg植物(wù)葉片加入1ml RNA提取試劑。

1.1.2動物(wù)組織：按10-30mg組織加入1ml RNA提取試劑，用電(diàn)動勻漿器(qì)或者一(yī)次性研磨杵充分勻漿。

1.2 培養細胞中提取總RNA：

1.2.1貼壁細胞：無須胰酶消化，可直接用RNA提取試劑進行裂解，每10cm²培養面積加1ml RNA提取試劑。

1.2.2懸浮細胞：可直接離心收集、裂解，每1ml RNA提取試劑可裂解5×10⁶動物(wù)或酵母細胞，或10⁷細菌細胞。

1.3 血液中提取總RNA：

直接取新鮮的血液，加入3倍體積紅(hóng)細胞裂解液，混勻後常溫放(fàng)置10分鍾，9,000 g離心1分鍾。徹底吸棄上(shàng)清，收集白(bái)細胞沉澱。每100-200μl血液收集的白(bái)細胞沉澱加入1ml RNA提取試劑。

2．分層（Phase Separation）

根據樣品，選擇使用方法2.1或者方法 2.2。如果不确定，則使用方法2.2。

2.1  (細胞，血液，一(yī)般動物(wù)組織) – 常溫靜(jìng)置 5 分鍾，再按照(zhào) 1 ml RNA提取試劑 使用 200 μl 的比例加入氯仿，用力颠倒離心管以混勻；常溫靜(jìng)置 3 -5 分鍾使之分層後，4℃12,000g離心 15 分鍾。

2.2  (植物(wù)，脂肪及肝髒等某些雜(zá)質含量較高(gāo)的樣品) – 常溫靜(jìng)置 5 分鍾後，4℃12,000 g離心 10 分鍾，将上(shàng)清移入另外一(yī)個(gè)離心管中。再按照(zhào) 1 ml RNA提取試劑使用 200 μl 的比例加入氯仿，用力颠倒離心管以混勻。常溫靜(jìng)置 2 - 5 分鍾使之分層後，4℃12,000 g離心 15 分鍾。

注：4℃ 離心對于降低(dī)基因組 DNA 的污染是很重要的。

雜(zá)質含量高(gāo)的樣品一(yī)定要使用 2.2 操作。該操作不僅可以将大部分雜(zá)質離心去除，也可以将大片段的基因組 DNA 離心去除，方便加入氯仿後的分層，不過，如果想同時抽提總 RNA 和基因組 DNA，則使用 2.1操作。

加入氯仿後的混勻是非常重要的，否則靜(jìng)止分相(xiàng)易出現分相(xiàng)倒置，即水(shuǐ)相(xiàng)在離心管下(xià)部而有機(jī)相(xiàng)在上(shàng)部。不推薦振蕩混勻，而推薦直接用手混勻：将管底斜向朝上(shàng)，手斜向快速搖動，使體系成粉色乳狀。

3．RNA沉澱（RNA Precipitation）

小(xiǎo)心将上(shàng)層水(shuǐ)相(xiàng)（通(tōng)常可吸取550 μl）移至另外一(yī)個(gè)離心管中，再加入等體積冰冷的異丙醇混勻，常溫放(fàng)置10 - 20 分鍾，4℃12000g離心10min，棄上(shàng)清，RNA沉澱于管底。

注：

中間層和紅(hóng)色下(xià)層置于4℃保存，以便接下(xià)去抽提基因組 DNA。

用冰冷的異丙醇能(néng)更迅速的沉降RNA。

取上(shàng)層水(shuǐ)相(xiàng)時要特别小(xiǎo)心，絕對不要吸入白(bái)色中間層及紅(hóng)色下(xià)層。移取水(shuǐ)相(xiàng)時要使用小(xiǎo)體積移液器(qì)：200 μl 移液器(qì)，吸頭的尖

嘴要貼在管壁，慢(màn)慢(màn)松手吸出液體。

對于脂肪類組織，包括腦(nǎo)組織，在上(shàng)清的最上(shàng)層為(wèi)脂肪，取上(shàng)清時不要吸入，必要時用等體積氯仿對上(shàng)清再抽提一(yī)次。

棄上(shàng)清後，将離心管置于離心機(jī)中快甩離心數秒(miǎo)，再用移液器(qì)将殘留液體小(xiǎo)心吸出。這是最徹底的去除上(shàng)清的方法，比倒掉上(shàng)清後再将離心管倒扣在吸水(shuǐ)紙(zhǐ)上(shàng)的方法可靠得多(duō)。如果是雜(zá)質含量高(gāo)的樣品，強烈建議增加此步操作。

4．RNA漂洗（RNA Wash）

4.1 RNA沉澱中加入1ml 75%乙醇（用RNase-free水(shuǐ)配制），溫和振蕩離心管，懸浮沉澱。每1ml RNA提取試劑加入1ml 75％乙醇。

4.2 4℃7,500 g離心5min，棄上(shàng)清。

注：轉速不要高(gāo)于7,500g，否則得到(dào)的RNA不易溶解。

4.3短暫快速離心，用移液器(qì)小(xiǎo)心吸棄上(shàng)清，注意不要吸棄沉澱。常溫放(fàng)置1-2分鍾晾幹沉澱。

注：RNA樣品不要過于幹燥，否則很難溶解。

5. 溶解RNA（Redissolving the RNA）

根據需要，沉澱中加入适量（一(yī)般可加50-100μl）RNase-free水(shuǐ)，輕彈管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存。

實驗示例：

 1.2%瓊脂糖膠   1×TAE 150V 25min RealSafe Red預染

RNA提取試劑提取步驟：K562懸浮細胞，1 ml收集（6×106/ml），PBS漂洗兩遍，加入1 ml RNA提取試劑，懸浮後常溫靜(jìng)置10分鍾，加入氯仿或氯仿替代物(wù)200 μl，徹底混勻後靜(jìng)置10分鍾，自(zì)然分相(xiàng)，4度 13000 rpm 離心15分鍾，上(shàng)清中加入等體積異丙醇，常溫靜(jìng)置20分鍾，4度 13000 rpm離心15分鍾，沉澱用1 ml 75%乙醇漂洗，4度 8000rpm 離心2分鍾，沉澱溶于50μl RNase-free水(shuǐ)中。

RTR2306操作簡述如下(xià)：K562懸浮細胞，1ml收集（6×106/ml），PBS漂洗兩遍（平行做2管）。沉澱中加入350 μl 裂解液RL（已加β-ME），常溫裂解5分鍾，裂解物(wù)加到(dào)DNA清除柱CS中，離心收集到(dào)2 ml離心管中，離心管中加入0.5倍體積無水(shuǐ)乙醇，全部溶液加到(dào)RNA吸附柱CR中，離心，随後清除柱CS和RNA吸附柱CR一(yī)次RD漂洗，2次RW漂洗，最後每個(gè)吸附柱用50 μl RNase-free水(shuǐ)洗脫，合并兩管得到(dào)100 μl RNA和100 μl去除的基因組DNA。