Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H^-）

       M-MLV反轉錄酶(RNase缺失)      

●  産品貨号及規格：

● 産品簡介：

M-MLV反轉錄酶(RNase H^-)，是一(yī)種經過改造和優化的反轉錄酶。和普通(tōng)的M-MLV反轉錄酶相(xiàng)比，缺失了Ribonuclease H (RNase H)酶活性，不能(néng)夠選擇性剪切RNA和DNA雜(zá)合雙鏈中的RNA，可以合成長(cháng)片段從(cóng)DNA。

本産品中M-MLV反轉錄酶(RNase H^-)的濃度為(wèi)200 U/μl，用于體積為(wèi)20微升的反轉錄體系時足夠進行10次反轉錄反應。

特點：M-MLV反轉錄酶(RNase H^-)可以合成長(cháng)達9-13kb的cDNA。該反轉錄酶的最适反應溫度為(wèi)42-45℃并且在55℃時仍然有很高(gāo)活性，可以避免普通(tōng)的M-MLV反轉錄酶(RNase H^-)在37℃反應時的一(yī)些不足。

用途：M-MLV反轉錄酶(RNase H^-)常用于在獲得總RNA或mRNA後cDNA第一(yī)條鏈的合成。合成的cDNA第一(yī)條鏈後續可以用于PCR、real-time PCR、cDNA第二條鏈的合成等。

來源：該反轉錄酶(RNase H^-)由大腸杆菌表達

活性定義：One unit of the enzyme incorporates 1 nmol of dTMP into a polynucleotide fraction in 10 min at37℃. Enzyme activity is assayed in50 mMTris-HCl (pH 8.3),6 mMMgCl₂,10 mMDTT,40 mMKCl,0.5 mMdTTP, 0.4 MBq/ml [³H]-dTTP0.4 mMpolyA?oligo(dT)_12-18.

純度：不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶和RNA酶，可以滿足常規反轉錄合成cDNA第一(yī)條鏈等的需要。

酶儲存溶液：50 mMTris, pH 8.3,100mMNaCl,1 mMEDTA,5 mMDTT, 0.1% Triton X-100 and 50% glycerol。

5×RT buffer：250 mMTris, pH 8.3 at25℃,250 mMKCl,20 mMMgCl₂，50mM DTT。

失活或抑制：70℃孵育10分鍾可以導緻M-MLV反轉錄酶(RNase H^-)失活；EDTA、EGTA等螯合劑、無機(jī)磷酸鹽或焦磷酸鹽以及聚氨(polyamine)對該反轉錄酶(Rnase H^-)有抑制作用。

● 使用說明：

cDNA第一(yī)鏈合成：

1. 0.2ml PCR管中配制模闆/引物(wù)變性混合液：

注：* Total RNA 的使用量一(yī)般為(wèi)1 ng-1 μg；mRNA的使用量一(yī)般為(wèi) 10 pg-1 μg。

2.70℃保溫 10 分鍾後迅速在冰上(shàng)急冷 2 分鍾以上(shàng)。

注：此步驟是打開(kāi)RNA的一(yī)些比較穩定的二級結構。

3. 離心數秒(miǎo)鍾使模闆 RNA/引物(wù)的變性混合液聚集于離心管底部。

4. 在上(shàng)述離心管中配制下(xià)列反轉錄反應液。

* 當起始模闆 RNA量＞500 ng 時， M-MLV（RNase H^-）的使用量應＞0.25 μl。

5. 若使用Oligo(dT)₁₈或基因特異性引物(wù)，42℃溫育30 min；若使用随機(jī)引物(wù)，先30℃溫育5 min，之後42℃溫育30 min；

6. 70℃保溫10分鍾後冰上(shàng)冷卻，得到(dào)的 cDNA溶液可直接用于PCR擴增，PCR擴增時 cDNA溶液的推薦使用量50μl體系加2 μl。

注：cDNA溶液置于-20℃可保存半年(nián)；置于-80℃可長(cháng)期儲存。