2×SYBR qPCR MasterMix（Universal）
● 産品包裝：
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組成
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RTQ3101-02
(可做40次50 μl反應)
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RTQ3101-03
(可做200次50 μl反應)
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RTQ3101-04
(可做1000次50 μl反應)
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長(cháng)期貯存
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2×SYBR qPCR MasterMix
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1ml
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5×1ml
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25×1ml
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-20℃
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RNase-free water
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1 ml
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5×1 ml
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25×1 ml
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-20℃
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注：以50μl qPCR反應體系為(wèi)例，每次使用25 μl 2×MasterMix，1 ml可做40次 50μl qPCR反應。
● 儲存條件(jiàn): -20℃避光(guāng)保存；經常使用時，一(yī)旦融化後請4℃貯存，4℃保存至少3個(gè)月(yuè)；盡量避免反複凍融。
● 産品簡介：
本制品是采用SYBR® Green I嵌合熒光(guāng)法進行Real Time PCR的專用試劑。已經将 Hot-Start DNA聚合酶、dNTP、特殊穩定劑、優化的反應緩沖液和 SYBR® Green I 等試劑預混成一(yī)種适合 Real Time PCR反應檢測用 2×MasterMix試劑，具有靈敏度高(gāo)、特異性強、穩定性好等特點。
本制品使用新型抗體修飾的 HotStart Taq DNA聚合酶，并結合精心優化的反應 Buffer，從(cóng)而有效抑制低(dī)溫下(xià)的非特異性擴增，提高(gāo)反應特異性和擴增效率，能(néng)夠在更寬廣的範圍内進行準确定量。使用時隻需加入模闆、引物(wù)和水(shuǐ)，便可在寬廣的定量區域内得到(dào)良好的标準曲線，對目的基因進行準确定量檢測，重複性好，可信度高(gāo)。
預混液中含有優化的校正染料，與一(yī)系列qPCR設備兼容，包括需要ROX校正的儀器(qì)，實驗操作過程中不需要額外添加校準染料來校正儀器(qì)。
● 注意事(shì)項
1. 本制品中已經含有優化的校正染料，客戶無需再添加校正染料，可以直接使用。
2. 本制品含SYBR® Green I，強光(guāng)下(xià)易分解，使用時避免長(cháng)時間強光(guāng)照(zhào)射本制品。
3. 建議在冰上(shàng)配制qPCR反應液，再放(fàng)入qPCR儀器(qì)中擴增。可以提高(gāo)擴增特異性，減少背景。
4.-20℃下(xià)保存時間較長(cháng)，有微量沉澱産生(shēng)，充分混勻後不影響使用。本制品已經優化了反應緩沖液中的Mg2+濃度，無需再調節Mg2+濃度。
5. 模闆DNA：用本産品，cDNA、基因組DNA、質粒DNA、病毒DNA等都可作為(wèi)模闆。在添加DNA模闆時請注意模闆量對PCR擴增的影響。本産品建議添加量為(wèi)：cDNA添加量不應超過總反應體系的10%；基因組DNA為(wèi)模闆時，為(wèi)避免在高(gāo)濃度區域出現線性差的情況，請注意添加量小(xiǎo)于500 ng；病毒DNA也可作為(wèi)PCR模闆，添加時請以300 ng為(wèi)上(shàng)限；由于質粒DNA濃度和拷貝數很高(gāo)，在添加PCR模闆之前最好進行稀釋梯度試驗，以便确定合适的質粒DNA拷貝數。
6. 引物(wù)：
建議每條引物(wù)工(gōng)作濃度200 nM-800 nM；為(wèi)得到(dào)高(gāo)靈敏度定量性的數據，引物(wù)的設計非常重要。以下(xià)列舉了設計引物(wù)時需注意的一(yī)般事(shì)項。
a) 引物(wù)長(cháng)度請設定為(wèi)18bp～30bp、GC含量為(wèi)40%～65%；
b) 擴增片段一(yī)般小(xiǎo)于300bp，請盡量設定在80bp～150bp。過長(cháng)的片段容易導緻擴增效率降低(dī)；
c) 如設計mRNA為(wèi)目的片段的引物(wù)，設計應盡量橫跨内含子，以防止基因組DNA的擴增而引起假陽性；
d) 請盡量選擇Tm為(wèi)65℃～67℃；
e) A、G、C、T整體分布盡量均勻。不要有部分的GC rich或AT rich（特别是3'端）。避開(kāi)T/C（Polypyrimidine）或A/G（Polypurine）的連續結構；
f) 避開(kāi)引物(wù)内部或兩條引物(wù)之間有3個(gè)堿基以上(shàng)的互補序列。二條引物(wù)間的3'末端避開(kāi)有2個(gè)堿基以上(shàng)的互補序列；
g) 引物(wù)設計完成後要使用BLAST檢索确認引物(wù)的特異性。
此外，引物(wù)的純化純度對反應特異性有很大的影響。經過一(yī)般純化、純度較低(dī)的引物(wù)熒光(guāng)強度散亂，容易産生(shēng)非特異性産物(wù)，緻使熔解曲線出現雜(zá)峰。請盡可能(néng)使用HPLC級别純化，至少要用經Cartridge(OPC)級别以上(shàng)純化的引物(wù)。
7. 對照(zhào)設計：
1）No template control（NTC）：在qPCR反應體系中僅僅缺少模闆。用以檢測有無二聚體和試劑有無污染。
2）Reverse Transcripase control：用以評估逆轉錄反應中有無基因組DNA的污染。在逆轉錄反應中僅僅不含有逆轉錄酶。
● 使用說明：
1. 冰浴中徹底融化2×qMasterMix，避免渦旋震蕩，以免産生(shēng)過多(duō)氣泡，徹底混勻後快甩離心将溶液收集到(dào)管底。
2. 按照(zhào)下(xià)表在制備反應體系：
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50 μl反應體系
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20 μl反應體系
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終濃度
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2×qPCR MasterMix
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25 μl
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10 μl
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1×
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上(shàng)遊引物(wù) 10 μM
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1 μl
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0.4 μl
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0.2 μM
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下(xià)遊引物(wù) 10 μM
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1 μl
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0.4 μl
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0.2 μM
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模闆
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× μl
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x μl
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10pg-100ng
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水(shuǐ)
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補至50 μl
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補至20 μl
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3. 快甩離心将反應液收集到(dào)管底。
4. 檢測片段大于300 bp，qPCR儀上(shàng)推薦執行以下(xià)程序（三步法）：
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步驟
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溫度
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時間
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循環數
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初始變性
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95℃
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30 sec*
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1
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變性
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95℃
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15 sec
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40
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退火
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55-65℃
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30 sec
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延伸
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72℃
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30 sec
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熔解曲線
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使用機(jī)器(qì)默認采集程序
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檢測片段小(xiǎo)于300 bp，qPCR儀上(shàng)推薦執行以下(xià)程序（兩步法）：
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步驟
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溫度
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時間
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循環數
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初始變性
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95℃
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30 sec*
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1
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變性
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95℃
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15 sec
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40
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退火和延伸
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60℃
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60 sec
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熔解曲線
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使用機(jī)器(qì)默認采集程序
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注：由于本MasterMix中的Hot-start DNA聚合酶是經過抗體修飾的，初始變性95℃30 sec即可。
● 實驗結果分析
反應結束後加做融解曲線，以區分擴增産物(wù)及引物(wù)二聚體。根據擴增曲線和融解解曲線結果可進行PCR定量标準曲線的制作。
● 常見(jiàn)問題及處理
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問題
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可能(néng)原因
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推薦的解決方法
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無擴增曲線且無擴增産物(wù)（凝膠電(diàn)泳）
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反應體系中有PCR反應抑制劑
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更換或純化模闆DNA。
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引物(wù)設計不合理
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重新設計、合成引物(wù)。
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逆轉錄産物(wù)體積過量
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減少逆轉錄産物(wù)量以不超過反應體系的10%。
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加樣錯(cuò)誤或有試劑未加
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檢查是否加了所有的所需試劑。
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引物(wù)的降解
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通(tōng)過PAGE電(diàn)泳檢測引物(wù)完整性。
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退火溫度不正确
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優化退火溫度。
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無擴增曲線但有擴增産物(wù)（凝膠電(diàn)泳）
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qPCR儀設置不正确
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檢查dye selction，reference dye是否選擇正确
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失效的熒光(guāng)檢測
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熒光(guāng)檢測應在PCR循環的退火/延伸階段。
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熒光(guāng)PCR儀問題
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參考qPCR儀器(qì)說明書
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陰性對照(zhào)（NTC）有擴增曲線
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反應體系中有污染
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qPCR片段較小(xiǎo)，極易造成環境中氣溶膠污染。如果融解曲線分析，解鏈溫度和目的片段相(xiàng)同，凝膠電(diàn)泳中NTC中的片段大小(xiǎo)和目的片段相(xiàng)同，極有可能(néng)是反應體系中某一(yī)或某些試劑污染所引起的。建議換至沒有污染源的環境進行PCR體系的配制。
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引物(wù)二聚體
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進行溶解曲線分析，如果擴增曲線的解鏈溫度小(xiǎo)于80℃，凝膠電(diàn)泳片段大小(xiǎo)和目的片度不符。請重新設計引物(wù)。
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提高(gāo)退火溫度3℃。
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PCR效率高(gāo)于110%
(斜率>-3.1）
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有非特異性擴增
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溶解曲線分析非特異性擴增；優化引物(wù)設計
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PCR擴增效率低(dī)于90%
(斜率<-3.6)
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反應體系中有PCR反應抑制劑
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更換或純化模闆DNA
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PCR擴增條件(jiàn)不合适引起擴增效率降低(dī)。
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确認引物(wù)濃度。注意qPCR Master Mix是否失效。
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引物(wù)設計
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重新設計引物(wù)，避免擴增區域的DNA二級結構。
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實時熒光(guāng)曲線線性不好
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模闆DNA含量較低(dī)或過高(gāo)
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應調整樣品的DNA濃度。
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模闆DNA中含有抑制PCR擴增反應的物(wù)質
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對模闆DNA進行純化或更換模闆。
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質量不好的逆轉錄試劑盒合成的cDNA，逆轉錄反應液中所含的物(wù)質可能(néng)抑制PCR反應。
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請降低(dī)樣品濃度，或将樣品純化後再進行反應。建議使用品牌質量較好的cDNA合成逆轉錄試劑盒。
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CT值高(gāo)于預期值
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加入的模闆量太少
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适當增加模闆量。
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樣品被降解
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檢查樣品的完整性。
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引物(wù)不合适
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重新設計合成引物(wù)。
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CT值低(dī)于預期值
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加入了過多(duō)的模闆
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減少模闆量。
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PCR産物(wù)太長(cháng)
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一(yī)般采用100-150bp的産物(wù)長(cháng)度，一(yī)般不超過500bp
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CT值的标準差>0.16
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取樣不準确
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每種樣品的反應混合液單獨配制，充分混勻；
qPCR之前要離心，管壁不要沾有反應液。
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ΔRn值太小(xiǎo)
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PCR效率太低(dī)
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優化PCR反應條件(jiàn)。
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目标模闆數太低(dī)
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增加模闆量。
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擴增曲線的熒光(guāng)信号弱，或擴增曲線呈鋸齒狀
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PCR的延伸時間過短即熒光(guāng)讀(dú)取時間不充分，熒光(guāng)收集不能(néng)充分完成。
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适當增加延伸時間。
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以少于PCR儀器(qì)标準條件(jiàn)的反應體積進行擴增，熒光(guāng)收集量的誤差會(huì)增大
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應增加反應體積以滿足PCR儀器(qì)标準。
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