普通(tōng)質粒小(xiǎo)提試劑盒（目錄号：RTP2102）

● 試劑盒内容及保存：

● 儲存條件(jiàn)和效期：

本試劑盒在室溫（25℃左右）幹燥條件(jiàn)下(xià)，可保存1年(nián)；更長(cháng)時間的保存可置于2–8℃。2–8℃保存條件(jiàn)下(xià)，若溶液産生(shēng)沉澱，應在使用前置于37℃下(xià)溶解沉澱至溶液澄清後再使用。單獨包裝的RNase A 在-20℃可穩定保存1年(nián)以上(shàng)。加入RNase A後的溶液P1應置于2–8℃保存，可穩定保存半年(nián)。

● 産品簡介及使用說明：

本試劑盒采用經典的堿裂解法裂解細菌，再通(tōng)過離心吸附柱在高(gāo)鹽狀态下(xià)特異性地結合DNA的特性，可以從(cóng)1–5ml大腸杆菌LB培養液中快速提取3–20μg純淨的高(gāo)拷貝質粒DNA。提取的質粒可适用于各種常規操作，包括酶切、PCR、測序、連接和轉化等實驗。然而，對質粒純度要求更高(gāo)的轉染實驗（要求無内毒素），此試劑盒不能(néng)達到(dào)要求。另外，盡管該試劑盒可以抽提較大的質粒（>10kb），但我們不推薦使用。如果一(yī)定要使用，請參考以下(xià)方法：加大菌體使用量（使用5–10 ml過夜培養物(wù)），同時按照(zhào)比例增加P1、P2、P3的用量；洗脫緩沖液應在70℃預熱，在吸附和洗脫時可以适當的延長(cháng)時間，以增加提取效率，其它步驟相(xiàng)同。

● 産品特點：

使用了Lysis Dye，菌體裂解是否完全一(yī)目了然。由于判斷菌體裂解和中和是否徹底更主要取決于操作者的經驗，所以我們增加了Lysis Dye（一(yī)種能(néng)使裂解/中和體系變換顔色的試劑）來幫助觀察裂解/中和的程度。加入P1後，Lysis Dye使菌液變為(wèi)渾濁的紅(hóng)色；加入P2後，Lysis Dye立即使溶液變為(wèi)澄清的紅(hóng)色，裂解是否完全隻要觀察紅(hóng)色溶液是否澄清，如果紅(hóng)色非常均一(yī)，表明裂解充分；在完全裂解的體系中加入P3混勻後，體系立即變為(wèi)黃色，任何紅(hóng)色的殘留表明沒有完全混勻或者中和不徹底。

● 準備工(gōng)作：

1 将試劑盒附帶的RNase A全部加入到(dào)溶液P1中（如15ml P1中加入150μl RNase A），混勻後4℃貯存。

2 按照(zhào)标簽所示在漂洗液PW中加入無水(shuǐ)乙醇，混勻後蓋緊瓶蓋後室溫貯存備用。

3 每次使用前請檢查溶液P2、溶液P3是否有沉澱生(shēng)成，如果出現沉澱，37℃溫浴至沉澱溶解後再使用。

● 使用Lysis Dye的标準操作步驟：

如非指出，所有離心步驟均為(wèi)使用台式離心機(jī)在室溫下(xià)離心。

1．   取1–5 ml過夜培養的菌液加入離心管中，10,000g 離心1分鍾，盡量吸除上(shàng)清。

注：菌液較多(duō)時可以通(tōng)過幾次離心将菌體沉澱收集到(dào)一(yī)個(gè)離心管中。

2．   向菌體沉澱的離心管中加入250 μl溶液P1（請先檢查是否已加入RNaseA）和5μl Lysis Dye，使用移液器(qì)或渦旋振蕩器(qì)徹底懸浮細菌細胞沉澱，此時溶液為(wèi)渾濁的紅(hóng)色。

注：如果有未徹底混勻的菌塊，會(huì)影響裂解，導緻提取量和純度偏低(dī)。

3．   加入250 μl溶液P2，溫和地上(shàng)下(xià)翻轉6–8次使菌體充分裂解，此時溶液變為(wèi)澄清的紅(hóng)色。

注：溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免污染基因組DNA；所用時間絕對不應超過5分鍾 ，以免質粒受到(dào)破壞；紅(hóng)色溶液應該透明均一(yī)，如有渾濁紅(hóng)色顆粒，表明裂解不充分，會(huì)大大降低(dī)質粒提取效率。

4．   加入350 μl溶液P3，立即溫和地上(shàng)下(xià)翻轉，充分混勻，混勻充分的标志(zhì)是溶液完全呈透明的黃色，如有可見(jiàn)紅(hóng)色，說明混勻不徹底。10,000g 離心10分鍾。

注：P3加入後應立即混合，避免産生(shēng)局部沉澱。

左側未完全混勻，有紅(hóng)色；右側完全混勻，呈均勻黃色

5．  小(xiǎo)心地将上(shàng)清轉移到(dào)吸附柱CP中（吸附柱放(fàng)入收集管中），10,000g離心30–60秒(miǎo)，倒掉收集管中的廢液，将吸附柱CP重新放(fàng)回收集管中。

6．   向吸附柱CP中加入700 μl漂洗液PW（請先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇），10,000g 離心30–60秒(miǎo)，倒掉收集管中的廢液，将吸附柱CP重新放(fàng)回收集管中。

7      向吸附柱CP中加入500 μl漂洗液PW，10,000g 離心30–60秒(miǎo)，倒掉收集管中的廢液。

8.  将吸附柱CP重新放(fàng)回收集管中，10,000g 離心2分鍾。

注：此步驟目的是将吸附柱中殘餘的漂洗液去除，絕對不可省略，因為(wèi)漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響後續實驗（酶切，PCR等）。

9.  将吸附柱CP置于一(yī)個(gè)幹淨的1.5ml離心管中，向吸附膜的中央部位懸空滴加50–100 μl洗脫緩沖液EB，室溫放(fàng)置2分鍾，10,000g離心2分鍾将質粒溶液收集到(dào)離心管中，-20℃保存。

注：● 為(wèi)了增加質粒的回收效率，可将得到(dào)的洗脫液重新加入離心吸附柱中，再次離心收集。

● 洗脫緩沖液體積不應少于50 μl，體積過小(xiǎo)影響回收效率。

● 洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水(shuǐ)做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5範圍内，pH值低(dī)于7.0會(huì)降低(dī)洗脫效率。

●不使用Lysis Dye的标準操作步驟：

如非指出，所有離心步驟均為(wèi)使用台式離心機(jī)在室溫下(xià)離心。

1．   取1–5 ml過夜培養的菌液加入離心管中，10,000 g離心1分鍾，盡量吸除上(shàng)清。

注：菌液較多(duō)時可以通(tōng)過幾次離心将菌體沉澱收集到(dào)一(yī)個(gè)離心管中。

2．   向菌體沉澱的離心管中加入250 μl溶液P1（請先檢查是否已加入RNaseA），使用移液器(qì)或渦旋振蕩器(qì)徹底懸浮細菌細胞沉澱。

注：如果有未徹底混勻的菌塊，會(huì)影響裂解，導緻提取量和純度偏低(dī)。

3．  加入250 μl溶液P2，溫和地上(shàng)下(xià)翻轉6–8次使菌體充分裂解。

注：溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免污染基因組DNA；所用時間絕對不應超過5分鍾，以免質粒受到(dào)破壞。

4．   加入350 μl溶液P3，立即溫和地上(shàng)下(xià)翻轉6–8次，充分混勻，此時會(huì)出現白(bái)色絮狀沉澱。10,000g 離心10分鍾。

注：P3加入後應立即混合，避免産生(shēng)局部沉澱。如果上(shàng)清中還(hái)有微小(xiǎo)白(bái)色沉澱，可再次離心後取上(shàng)清。

5．  小(xiǎo)心地将上(shàng)清轉移到(dào)吸附柱CP中（吸附柱放(fàng)入收集管中），10,000g 離心30–60秒(miǎo)，倒掉收集管中的廢液，将吸附柱CP重新放(fàng)回收集管中。

6．   向吸附柱CP中加入700 μl漂洗液PW（請先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇），10,000g 離心30–60秒(miǎo)，倒掉收集管中的廢液，将吸附柱CP重新放(fàng)回收集管中。

7      向吸附柱CP中加入500 μl漂洗液PW，10,000g 離心30–60秒(miǎo)，倒掉收集管中的廢液。

8.  将吸附柱CP置于收集管中，10,000g 離心2分鍾。

注：此步驟目的是将吸附柱中殘餘的漂洗液去除，絕對不可省略，因為(wèi)漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響後續實驗（酶切，PCR等）。

9．   将吸附柱CP置于一(yī)個(gè)幹淨的1.5ml離心管中，向吸附膜的中央部位懸空滴加50–100 μl洗脫緩沖液EB，室溫放(fàng)置2分鍾，10,000g離心2分鍾将質粒溶液收集到(dào)離心管中，-20℃保存。

注：● 為(wèi)了增加質粒的回收效率，可将得到(dào)的洗脫液重新加入離心吸附柱中，再次離心收集。

● 洗脫緩沖液體積不應少于50 μl，體積過小(xiǎo)影響回收效率。