10bp 雙鏈RNA ladder
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貨号
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名稱
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規格
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RTM504
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10bp 雙鏈RNA ladder
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25次
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● 産品組成：
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貨号
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名稱
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規格
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RTM504-01
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10bp dsRNA ladder
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100 μl
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RTM504-02
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5×RNA上(shàng)樣緩沖液
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1 ml
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● 産品簡介：
10bp
dsRNA ladder由長(cháng)度20
bp至1,000
bp的10條dsRNA（雙鏈RNA）片段組成，片段大小(xiǎo)為(wèi)20，30，40，50，100，200，300，400，500，1000 bp，其中100 bp的雙鏈 RNA片段為(wèi)增強帶，顯示亮帶，可作為(wèi)參照(zhào)。
本産品為(wèi)雙鏈RNA
Marker，适用于非變性的PAGE電(diàn)泳，不适用于變性PAGE電(diàn)泳（尿素），也不建議用于瓊脂糖電(diàn)泳。可以用于制備siRNA（小(xiǎo)幹擾RNA，Small interfering RNA）時标記雙鏈RNA片段大小(xiǎo)。
按照(zhào)每次上(shàng)樣5
μl計算(suàn)，該産品配制好即用型産品可以使用約25次。
注意：
1.由于RNA極易污染後降解，實驗操作時采取必要措施防止RNase污染，如佩戴一(yī)次性手套，使用專用RNase-free吸頭及離心管等；不要在同一(yī)區域進行涉及RNase的實驗，如質粒提取等。
2.由于dsRNA序列不同，顯示的片段長(cháng)度會(huì)略有不同；使用的siRNA片段中含有DNA片段時，片段大小(xiǎo)會(huì)略有差異。
● 儲存條件(jiàn)：
-20℃ 貯存，有效期一(yī)年(nián)。
● 使用方法：
一(yī)、即用型10bp dsRNA ladder配制方法：
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即用型10bp dsRNA ladder配制量
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5 μl
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10 μl
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15 μl
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20 μl
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10bp
dsRNA ladder
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4 μl
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8 μl
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12 μl
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16 μl
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5×RNA上(shàng)樣緩沖液
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1 μl
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2 μl
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3 μl
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4 μl
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注：即用型dsRNA Marker建議現用現配，不建議配制後保存，保存後會(huì)導緻電(diàn)泳後條帶模糊。
二、 TBE-PAGE凝膠制備：
2.1 制備凝膠步驟：
2.1.1參照(zhào)凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。
2.1.2按照(zhào)表一(yī)将不同體積的成分在小(xiǎo)燒杯或試管中混合；最後加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。
注：10 bp dsRNA ladder 适用于配制15%TBE-PAGE膠。
2.1.3在凝膠模具中灌入适量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃闆頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然後在分離膠溶液上(shàng)輕輕覆蓋一(yī)層1-2 cm的無水(shuǐ)乙醇，使凝膠表面保持平整。
2.1.4靜(jìng)置10-20分鍾，待分離膠和乙醇層之間出現一(yī)個(gè)清晰的界面後，說明凝膠已聚合。
表一(yī) TBE-PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，适用于1mm厚度小(xiǎo)闆膠)
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各組份體積（ml）
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最佳dsRNA分離範圍
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凝膠濃度
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滅菌水(shuǐ)
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30%PAA(29:1)
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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70-450 bp
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6%
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3
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1.0
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1
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0.05
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0.005
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60-460 bp
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8%
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2.66
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1.34
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1
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0.05
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0.005
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50-300 bp
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10%
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2.33
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1.67
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1
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0.05
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0.005
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40-200 bp
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12%
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2
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2.0
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1
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0.05
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0.005
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25-150 bp
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15%
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1.5
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2.5
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1
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0.05
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0.005
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5-100 bp
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20%
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0.66
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3.34
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1
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0.05
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0.005
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2.1.5去除覆蓋在分離膠上(shàng)的乙醇；按照(zhào)表二将不同體積成分在一(yī)個(gè)小(xiǎo)燒杯或試管中混合；最後加入10%過硫酸铵和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。
表二 TBE-PAGE 4%濃縮配方表 (總體積1.5 ml，适用于1mm厚度小(xiǎo)闆膠)
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各組份體積（ml） 總體積1.5 ml
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凝膠濃度
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滅菌水(shuǐ)
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30%PAA(29:1)
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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1
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0.2
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0.3
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0.02
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0.002
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2.1.6将濃縮膠溶液加至分離膠的上(shàng)面，直至凝膠溶液到(dào)達前玻璃闆的頂端；将梳子插入凝膠内，避免産生(shēng)氣泡。
2.1.7靜(jìng)置30-60分鍾，等待濃縮膠聚合。
注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高(gāo)時，聚合較快；冬天氣溫低(dī)時，聚合時間會(huì)延長(cháng)。可以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。
2.2電(diàn)泳：
2.2.1 将凝膠闆固定在電(diàn)泳裝置上(shàng)，往上(shàng)槽和下(xià)槽中加入1×TBE電(diàn)泳液，1 ml吸頭沖洗加樣孔1-2次。
2.2.2 取待測樣品，加入相(xiàng)應體積5×RNA上(shàng)樣緩沖液，如8 μl樣品加2 μl 上(shàng)樣緩沖液，短暫離心後取5-10 μl上(shàng)樣。 即用型10 bp dsRNA ladder 1 mm厚10齒梳子上(shàng)樣5 μl，其餘梳齒和厚度凝膠适量調整上(shàng)樣量。
2.2.3 連接電(diàn)源線，打開(kāi)電(diàn)源開(kāi)關。150 V穩壓電(diàn)泳，至溴酚藍指示前沿距離玻璃下(xià)沿2 cm時結束電(diàn)泳（參見(jiàn)下(xià)圖）。
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TBE-PAGE電(diàn)泳
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恒電(diàn)壓
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起始電(diàn)流
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結束電(diàn)流
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電(diàn)泳時間
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150 V
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15-25
mA/闆膠
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8-15 mA/闆膠
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50+min
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15%T3.3C TBE-PAGE
溴酚藍前沿大小(xiǎo)約15bp dsRNA，二甲苯菁大小(xiǎo)約60bp dsRNA。
3、染色：
3.3.1 漂洗：玻璃闆上(shàng)拆下(xià)凝膠後，适量蒸餾水(shuǐ)漂洗3-5分鍾。
3.3.2 染色液配制：
TBE-PAGE膠可以使用EB或RealSafe核酸染料後染染色，以下(xià)程序用RealSafe Red核酸染料（貨号：GR002）進行染色。即用型染色液配制：
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即用型RealSafe核酸染色液
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100 ml
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1×TBE
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100 ml
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RealSafe Red核酸染料
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20 μl
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3.3.3染色和觀察：
凝膠浸泡于即用型染色液中，常溫避光(guāng)搖床40-60 rpm染色30 分鍾。紫外光(guāng)下(xià)觀察。
三、實驗示例：
15％TBE-PAGE電(diàn)泳
左1：10bp DNA ladder（貨号：RTM443） 5μl
左2：20bp DNA ladder（貨号：RTM441） 5μl
左3：即用型10 bp dsRNA ladder 5μl
（4 μl 10 bp dsRNA ladder加1 μl 5×RNA上(shàng)樣緩沖液）
凝膠長(cháng)度：8 cm
電(diàn)泳條件(jiàn)：穩壓150 V 起始電(diàn)流20 mA，終止電(diàn)流10 mA
電(diàn)泳緩沖液：1×TBE
電(diàn)泳時間：50分鍾
染色：RealSafe Red核酸染料後染30分鍾