單鏈DNA Marker（20-75 nt）

單鏈DNA Marker由不同長(cháng)度的單鏈DNA分子混合而成，7條帶的大小(xiǎo)為(wèi)20，25，30，35，40， 50，75 nt。35 nt 濃度約為(wèi)100 ng/μl，其餘條帶濃度約為(wèi)50 ng/μl。該産品已經含有上(shàng)樣緩沖液，使用前70度處理5分鍾後可以直接上(shàng)樣。該Marker适用于跑尿素變性膠，電(diàn)泳後使用單鏈DNA PAGE電(diàn)泳染色試劑盒（Cat：RTS5103），核酸PAGE電(diàn)泳染色試劑盒（Cat：RTS5102），核酸快速高(gāo)靈敏度染色試劑盒（Cat：RTS5101）或核酸染料如RealSafe Red（貨号：GR002）或RealSafe All（貨号：GR004）均可以得到(dào)清晰的條帶分離效果。

産品内附帶2×TBE尿素上(shàng)樣緩沖液（Cat：DL080-01），方便待檢樣品的上(shàng)樣。以每次上(shàng)樣5 μl計算(suàn)，該産品可以使用大約25次。

● 保存條件(jiàn)和運輸：

-20℃貯存；有效期2年(nián)；濕冰運輸。

● 使用方法：

注：以下(xià)使用方法均以8×10cm凝膠厚1.0mm示例，其他規格凝膠請适當調整。

一(yī). 凝膠制備：

1.1 可以選擇DNA尿素PAGE電(diàn)泳試劑盒（Cat：RTE4102））或按照(zhào)以下(xià)程序制膠：

表一(yī) TBE-尿素PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，适用于厚度1.0 mm小(xiǎo)闆膠)

單鏈DNA長(cháng)度	最佳凝膠濃度	尿素（克）	40%PAA （29:1）	10×TBE	補水(shuǐ)到(dào)總體積	10%APS	TEMED
200-1000 nt	5%	2.1克	0.625 ml	0.5 ml	5 ml	50 μl	5 μl
50-400 nt	8%	2.1克	1 ml	0.5 ml	5 ml	50 μl	5 μl
30-300 nt	10%	2.1克	1.25 ml	0.5 ml	5 ml	50 μl	5 μl
10-150 nt	15%	2.1克	1.875 ml	0.5 ml	5 ml	50 μl	5 μl
5-120 nt	20%	2.1克	2.5 ml	0.5 ml	5 ml	50 μl	5 μl

1.2在凝膠模具中灌入适量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃闆頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然後在分離膠溶液上(shàng)輕輕覆蓋一(yī)層1-5 cm的水(shuǐ)層，使凝膠表面保持平整。

1.3靜(jìng)置10-20分鍾，待分離膠和水(shuǐ)層之間出現一(yī)個(gè)清晰的界面後，說明凝膠已聚合。

注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高(gāo)時，聚合較快；冬天氣溫低(dī)時，聚合時間會(huì)延長(cháng)。可以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。

1.4去除覆蓋在分離膠上(shàng)的水(shuǐ)層；按照(zhào)表二将不同體積成分在一(yī)個(gè)小(xiǎo)燒杯中混合；最後加入10%過硫酸铵和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。

表二 TBE-尿素PAGE 4%濃縮配方表 (總體積2 ml，适用于1.0mm厚度膠)

	各組份體積（ml）
凝膠濃度	尿素	40%PAA（29:1）	10×TBE	滅菌水(shuǐ)	10%APS	TEMED
4%	0.84克	0.2 ml	0.2 ml	補水(shuǐ)至體積2 ml	20 μl	2 μl

1.5将濃縮膠溶液加至分離膠的上(shàng)面，直至凝膠溶液到(dào)達前玻璃闆的頂端；将梳子插入凝膠内，避免産生(shēng)氣泡。

1.6靜(jìng)置30-60分鍾，等待濃縮膠聚合。

二. 樣品制備：

2.1 取适量體積單鏈DNA Marker樣品（不用添加上(shàng)樣緩沖液）；待測樣品與等體積的2×TBE尿素上(shàng)樣緩沖液（Cat：DL080-01）混合，70℃處理5分鍾，冰浴制冷後待上(shàng)樣。

三.電(diàn)泳：

3.1. 預電(diàn)泳（可選）：電(diàn)泳槽内外加入适量1×TBE緩沖液穩壓200V預電(diàn)泳30分鍾。電(diàn)泳結束後，用1×TBE緩沖液徹底沖洗加樣孔2-3次，去除殘餘的尿素。

3.2.上(shàng)樣：根據梳齒确定Marker上(shàng)樣量，一(yī)般是10齒1mm厚梳子上(shàng)樣5 μl，15齒1mm厚梳子上(shàng)樣3 μl。

3.3. 連接電(diàn)源線，打開(kāi)電(diàn)源開(kāi)關，按照(zhào)以下(xià)條件(jiàn)電(diàn)泳。

	恒電(diàn)壓	起始電(diàn)流	結束電(diàn)流	電(diàn)泳時間	适用條件(jiàn)
推薦電(diàn)壓	200 V	15-20 mA/闆膠	10-15 mA/闆膠	60+ min	最佳電(diàn)壓，最優的分辨率

3.4. 等待上(shàng)樣緩沖液的溴酚藍指示前沿到(dào)凝膠底部時終止電(diàn)泳，取出凝膠進行後續實驗。

變性膠濃度	溴酚藍	二甲苯菁
5%	35 nt	130 nt
8%	19 nt	75 nt
10%	15 nt	55 nt
15%	10 nt	52 nt
20%	8 nt	35 nt

四．染色：

用單鏈DNA PAGE電(diàn)泳染色試劑盒（Cat：RTS5103），核酸PAGE電(diàn)泳染色試劑盒（Cat：RTS5102）或核酸快速高(gāo)靈敏度染色試劑盒（Cat：RTS5101）染色均可以得到(dào)清晰的條帶分離效果。注：如果使用核酸染料染色，RealSafe Red（貨号：GR002）或RealSafe All（貨号：GR004）核酸染料結合單鏈核酸效果最佳，強烈建議使用以便獲得最佳效果的膠圖。其餘染料如GelRed，Goldview，EB等染色效果不好。

● 注意事(shì)項：

1. 單鏈DNA Marker産品适用于變性PAGE垂直電(diàn)泳，不适用于水(shuǐ)平瓊脂糖凝膠電(diàn)泳。

● 電(diàn)泳示例：

1. 使用單鏈DNA PAGE電(diàn)泳染色試劑盒（貨号：RTS5103）染色：