25bp
DNA ladder
● 産品編号及規格：
RTM444
50次 (250 μl)
● 産品組成：
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貨号
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名稱
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規格
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RTM444-01
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25bp DNA ladder
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50次（250 μl）
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DL070-01
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6×Native-PAGE DNA上(shàng)樣緩沖液
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1 ml
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DL020-01
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6×DualColor DNA
loading buffer (雙染料)
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1 ml
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● 産品簡介：
本産品是由8條帶狀雙鏈DNA條帶組成的精準定量Marker，适用于聚丙烯酰胺凝膠電(diàn)泳中DNA條帶大小(xiǎo)和含量的分析。8條帶的大小(xiǎo)分别為(wèi)25，50，100，150，200，300，400，500bp。其中200bp
bp條帶為(wèi)加亮帶，含量為(wèi)100ng/5μl，其餘條帶濃度為(wèi)50ng/5μl。
本産品為(wèi)雙鏈DNA
Marker，适用于非變性的PAGE電(diàn)泳和瓊脂糖凝膠電(diàn)泳，不适用于尿素PAGE電(diàn)泳。由于片段較小(xiǎo)，如使用瓊脂糖分離，建議使用高(gāo)分辨率瓊脂糖凝膠電(diàn)泳分離。
按照(zhào)每次上(shàng)樣5
μl計算(suàn)，該産品可以使用50次。
● 儲存、效期及運輸：
-20℃ 貯存;有效期3年(nián)；濕冰運輸。
● 使用方法：
一(yī)、 TBE-PAGE凝膠分離：
1.1制備凝膠步驟：
1.1.1參照(zhào)凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。
1.1.2按照(zhào)表一(yī)将不同體積的成分在小(xiǎo)燒杯或試管中混合；最後加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。
注：25bp DNA ladder适用于配制15%TBE-PAGE膠。
1.1.3在凝膠模具中灌入适量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃闆頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然後在分離膠溶液上(shàng)輕輕覆蓋一(yī)層1-2 cm的無水(shuǐ)乙醇，使凝膠表面保持平整。
1.1.4靜(jìng)置10-20分鍾，待分離膠和乙醇層之間出現一(yī)個(gè)清晰的界面後，說明凝膠已聚合
表一(yī) TBE-PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，适用于1mm厚度小(xiǎo)闆膠)
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各組份體積（ml）
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最佳DNA分離範圍
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凝膠濃度
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滅菌水(shuǐ)
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30%PAA（29：1）
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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70-450 bp
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6%
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3
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1.0
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1.0
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0.05
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0.005
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60-460 bp
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8%
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2.66
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1.34
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1.0
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0.05
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0.005
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50-300 bp
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10%
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2.33
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1.67
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1.0
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0.05
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0.005
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40-200 bp
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12%
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2
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2.0
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1.0
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0.05
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0.005
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25-150 bp
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15%
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0.5
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2.5
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1.0
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0.05
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0.005
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5-100 bp
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20%
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0.66
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3.34
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1.0
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0.05
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0.005
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1.1.5去除覆蓋在分離膠上(shàng)的乙醇；按照(zhào)表二将不同體積成分在一(yī)個(gè)小(xiǎo)燒杯或試管中混合；最後加入10%過硫酸铵和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。
表二 TBE-PAGE 4%濃縮配方表 (總體積1.5 ml，适用于1mm厚度小(xiǎo)闆膠)
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各組份體積（ml）
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凝膠濃度
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滅菌水(shuǐ)
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30%PAA（29：1）
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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1.0
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0.2
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0.3
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0.02
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0.002
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1.1.6将濃縮膠溶液加至分離膠的上(shàng)面，直至凝膠溶液到(dào)達前玻璃闆的頂端；将梳子插入凝膠内，避免産生(shēng)氣泡。
1.1.7靜(jìng)置30-60分鍾，等待濃縮膠聚合。
注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高(gāo)時，聚合較快；冬天氣溫低(dī)時，聚合時間會(huì)延長(cháng)。可以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。
1.2 電(diàn)泳：
1.2.1 将凝膠闆固定在電(diàn)泳裝置上(shàng)，往上(shàng)槽和下(xià)槽中加入1×TBE電(diàn)泳液，1 ml吸頭沖洗加樣孔1-2次。
1.2.2 取待測樣品，加入相(xiàng)應體積6×Native PAGE DNA上(shàng)樣緩沖液，如5 μl樣品加1 μl 上(shàng)樣緩沖液，短暫離心後取5-10 μl上(shàng)樣。 25bp DNA
ladder已經含有上(shàng)樣緩沖液，1
mm厚10齒梳子直接上(shàng)樣5
μl，其餘梳齒和厚度凝膠适量調整上(shàng)樣量。
1.2.3 連接電(diàn)源線，打開(kāi)電(diàn)源開(kāi)關。200 V穩壓電(diàn)泳。至二甲苯菁指示前沿到(dào)達距離凝膠下(xià)沿二分之一(yī)位置時結束電(diàn)泳（~50bp），此時溴酚藍指示前沿在凝膠下(xià)沿邊界（~17bp）。
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PAGE凝膠濃度
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恒電(diàn)壓
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起始電(diàn)流
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結束電(diàn)流
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二甲苯菁
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溴酚藍
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電(diàn)泳時間
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15%
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200 V
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25-30
mA/闆膠
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10-18 mA/闆膠
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~50 bp
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~17 bp
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35+min
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1.3染色：
1.3.1 漂洗：玻璃闆上(shàng)拆下(xià)凝膠後，适量蒸餾水(shuǐ)漂洗3-5分鍾。
1.3.2 染色液配制：
TBE-PAGE膠可以使用RealSafe類染料後染染色，以下(xià)程序用RealSafe Red核酸染料（貨号：GR002）進行染色。即用型染色液配制：
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即用型RealSafe核酸染色液
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配制量100 ml
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1×TBE
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100 ml
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RealSafe Red核酸染料
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10 μl
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1.3.3染色和觀察：
凝膠浸泡于即用型染色液中，常溫避光(guāng)搖床40-60 rpm染色30 分鍾。紫外光(guāng)或藍光(guāng)儀下(xià)觀察。
二、 瓊脂糖凝膠分離：
2.1 瓊脂糖凝膠制備：
由于片段較小(xiǎo)，建議選用高(gāo)分辨率瓊脂糖（貨号AR1036）制膠。以下(xià)步驟以制備50
ml 3%凝膠為(wèi)例：
稱取1.5
g瓊脂糖于玻璃三角瓶中，加入50
ml 1×TAE，5 μl RealSafe Red核酸染料或其他核酸染料（如EB，GoldView），混勻，蓋好瓶蓋，微波爐中火加熱至沸騰，輕搖混勻，重複1-2次至瓊脂糖完全溶解，無可見(jiàn)顆粒。倒入制膠容器(qì)中，插好梳子，常溫凝固30-50分鍾至凝膠完全凝固。
2.2 電(diàn)泳：
取待測樣品，加入相(xiàng)應體積6×DualColor DNA loading buffer，如10 μl樣品加2 μl 上(shàng)樣緩沖液，短暫離心後取5-10 μl上(shàng)樣。 25bp DNA
ladder 1 mm厚10齒梳子上(shàng)樣5 μl，其餘梳齒和厚度凝膠适量調整上(shàng)樣量。
建議電(diàn)泳條件(jiàn)：凝膠濃度為(wèi)3％，電(diàn)泳電(diàn)壓8-10
v/cm（單位電(diàn)壓指電(diàn)泳槽陰陽極之間的距離電(diàn)壓，如陰極陽極之間的距離為(wèi)20 cm，可以用160-200
V電(diàn)壓進行穩壓電(diàn)泳），待溴酚藍指示前沿距離凝膠末端2 cm時終止電(diàn)泳，電(diàn)泳時間35-40分鍾。
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瓊脂糖濃度
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電(diàn)泳緩沖液
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二甲苯菁
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溴酚藍
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單位電(diàn)壓
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電(diàn)泳時間
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3%
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1×TAE
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~1000 bp
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~100 bp
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8-10 V/cm
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40min+
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1×TBE
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~700 bp
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~60 bp
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8-10 V/cm
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40min+
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2.3觀察條帶。
注：使用EB或Goldview染料時，由于染料本身帶正電(diàn)荷較多(duō)，随著(zhe)電(diàn)泳時間的延長(cháng)，染料會(huì)向陰極聚集，導緻小(xiǎo)片段核酸結合的染料含量降低(dī)，會(huì)出現小(xiǎo)片段的DNA片段紫外燈下(xià)亮度變弱或不可見(jiàn)。此時可以将膠浸泡于含有染料的電(diàn)泳緩沖液中染色15-20分鍾即可看(kàn)到(dào)小(xiǎo)片段。使用RealSafe類染料可以直接觀察條帶。
2.4 實驗示例：
