20bp DNA ladder

● 産品編号及規格：

RTM441          50次 (250 μl)    

● 産品組成：

● 産品簡介：

本産品是由13條帶狀雙鏈DNA條帶組成的精準定量Marker，适用于聚丙烯酰胺凝膠電(diàn)泳中DNA條帶大小(xiǎo)和含量的分析。13條帶的大小(xiǎo)分别為(wèi)20，40，60，80，100，120，140，160，180，200，300，400，500 bp。其中100bp和200bp條帶為(wèi)加亮帶，含量為(wèi)100ng/5μl，其餘條帶濃度為(wèi)50ng/5μl。

本産品為(wèi)雙鏈DNA Marker，适用于非變性的PAGE電(diàn)泳和瓊脂糖凝膠電(diàn)泳，不适用于尿素PAGE電(diàn)泳。由于片段較小(xiǎo)，如使用瓊脂糖分離，建議使用高(gāo)分辨率瓊脂糖凝膠電(diàn)泳分離。

按照(zhào)每次上(shàng)樣5 μl計算(suàn)，該産品可以使用50次。

● 儲存條件(jiàn)：

 -20℃ 貯存,有效期3年(nián)。

● 使用方法：

一(yī)、 TBE-PAGE凝膠分離：

1、制備凝膠步驟：

1.1參照(zhào)凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。

1.2按照(zhào)表一(yī)将不同體積的成分在小(xiǎo)燒杯或試管中混合；最後加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。

   注：20bp DNA ladder 适用于配制20%TBE-PAGE膠。

1.3在凝膠模具中灌入适量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃闆頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然後在分離膠溶液上(shàng)輕輕覆蓋一(yī)層1-2 cm的無水(shuǐ)乙醇，使凝膠表面保持平整。

1.4靜(jìng)置10-20分鍾，待分離膠和乙醇層之間出現一(yī)個(gè)清晰的界面後，說明凝膠已聚合

表一(yī) TBE-PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，适用于1mm厚度小(xiǎo)闆膠)

1.5去除覆蓋在分離膠上(shàng)的乙醇；按照(zhào)表二将不同體積成分在一(yī)個(gè)小(xiǎo)燒杯或試管中混合；最後加入10%過硫酸铵和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。

表二 TBE-PAGE 4%濃縮配方表 (總體積1.5 ml，适用于1mm厚度小(xiǎo)闆膠)

1.6将濃縮膠溶液加至分離膠的上(shàng)面，直至凝膠溶液到(dào)達前玻璃闆的頂端；将梳子插入凝膠内，避免産生(shēng)氣泡。

1.7靜(jìng)置30-60分鍾，等待濃縮膠聚合。

注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高(gāo)時，聚合較快；冬天氣溫低(dī)時，聚合時間會(huì)延長(cháng)。可以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。

2、電(diàn)泳：

2.1 将凝膠闆固定在電(diàn)泳裝置上(shàng)，往上(shàng)槽和下(xià)槽中加入1×TBE電(diàn)泳液，1 ml吸頭沖洗加樣孔1-2次。

2.2 取待測樣品，加入相(xiàng)應體積6×Native PAGE DNA上(shàng)樣緩沖液，如5 μl樣品加1 μl 上(shàng)樣緩沖液，短暫離心後取5-10 μl上(shàng)樣。 20bp DNA ladder  1 mm厚10齒梳子上(shàng)樣5 μl，其餘梳齒和厚度凝膠适量調整上(shàng)樣量。

2.3 連接電(diàn)源線，打開(kāi)電(diàn)源開(kāi)關。200V穩壓電(diàn)泳。至二甲苯菁指示前沿到(dào)達凝膠三分之二位置時結束電(diàn)泳（此時溴酚藍指示前沿已經跑出凝膠，不可見(jiàn)）。

3、染色：

3.1 漂洗：玻璃闆上(shàng)拆下(xià)凝膠後，适量蒸餾水(shuǐ)漂洗3-5分鍾。

3.2 染色液配制：

  TBE-PAGE膠可以使用EB或RealSafe類染料後染染色，以下(xià)程序用RealSafe Red核酸染料（貨号：GR002）進行染色。即用型染色液配制：

3.3染色和觀察：

  凝膠浸泡于即用型染色液中，常溫避光(guāng)搖床40-60 rpm染色30 分鍾。紫外光(guāng)下(xià)觀察。

二、 瓊脂糖凝膠分離：

1. 瓊脂糖凝膠制備：

  由于片段較小(xiǎo)，建議選用高(gāo)分辨率瓊脂糖（貨号AR1036）制膠。

以下(xià)步驟以制備50 ml 3%凝膠為(wèi)例：

稱取1.5 g瓊脂糖于玻璃三角瓶中，加入50 ml 1×TAE，5 μl RealSafe Red核酸染料或其他核酸染料（如EB，GoldView），混勻，蓋好瓶蓋，微波爐中火加熱至沸騰，輕搖混勻，重複1-2次至瓊脂糖完全溶解，無可見(jiàn)顆粒。倒入制膠容器(qì)中，插好梳子，常溫凝固30-50分鍾至凝膠完全凝固。

2. 電(diàn)泳：

取待測樣品，加入相(xiàng)應體積6×DualColor DNA loading buffer，如10 μl樣品加2 μl 上(shàng)樣緩沖液，短暫離心後取5-10 μl上(shàng)樣。 20bp DNA ladder  1 mm厚10齒梳子上(shàng)樣5 μl，其餘梳齒和厚度凝膠适量調整上(shàng)樣量。

建議電(diàn)泳條件(jiàn)：凝膠濃度為(wèi)3％，電(diàn)泳電(diàn)壓8-10 v/cm（單位電(diàn)壓指電(diàn)泳槽陰陽極之間的距離電(diàn)壓，如陰極陽極之間的距離為(wèi)20 cm，可以用160-200 V電(diàn)壓進行穩壓電(diàn)泳），待溴酚藍指示前沿距離凝膠末端2 cm時終止電(diàn)泳，電(diàn)泳時間35-40分鍾。

注：3% 瓊脂糖TAE電(diàn)泳中，溴酚藍大小(xiǎo)約為(wèi)20bp，二甲苯菁大小(xiǎo)約200bp。

3. 紫外燈下(xià)觀察條帶。

注：使用EB或Goldview染料時，由于染料本身帶正電(diàn)荷較多(duō)，随著(zhe)電(diàn)泳時間的延長(cháng)，染料會(huì)向陰極聚集，導緻小(xiǎo)片段核酸結合的染料含量降低(dī)，會(huì)出現小(xiǎo)片段的DNA片段紫外燈下(xià)亮度變弱或不可見(jiàn)。此時可以将膠浸泡于含有染料的1×TAE緩沖液中染色15-20分鍾即可看(kàn)到(dào)小(xiǎo)片段。

4. 實驗示例：