Long Taq DNA Polymerase
長(cháng)片段DNA聚合酶
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目錄号
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濃度
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包裝
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RTL3102-02
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5 U/μl
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500 U （100μl）
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RTL3102-03
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5 U/μl
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5×500 U（5×100μl）
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● 貯存
-20℃保存一(yī)年(nián)。
● 産品簡介
Long Taq DNA Polymerase是由pfu DNA Polymerase和Taq DNA聚合酶按照(zhào)一(yī)定的比例混合而成。兩種酶協同作用實現了擴增效率、合成速度和延伸性能(néng)的完美統一(yī)，在長(cháng)片段PCR反應中具有獨特的優勢，可以合成超長(cháng)的DNA片段。另外，此酶具有比Taq DNA聚合酶約5倍的PCR可信度。該酶的大多(duō)數PCR産物(wù)3’端帶堿基A，可以通(tōng)過TA克隆法進行克隆。
● 産品組成（RTL3102-02）
Long Taq DNA Polymerase（5U/μl） 100μl
10×Long Taq PCR buffer（含Mg2＋） 1ml
2×GC buffer 2×1 ml
産品組成（RTL3102-03）
Long Taq DNA Polymerase（5U/μl） 5×100μl
10×Long Taq PCR buffer（含Mg2＋） 5×1ml
2×GC buffer 10×1 ml
● 活性定義
1單位(U) Taq DNA Polymerase活力定義為(wèi)在74℃、30分鍾内，以活性化的大馬哈魚精子DNA作為(wèi)模闆/引物(wù)，将10 nmol脫氧核苷酸摻入到(dào)酸不溶物(wù)質所需的酶量。
● 酶貯存緩沖液
50 mM Tris-HCl (pH 8.0);0.1 mMEDTA;1 mMDTT;50 mMKCl ; Stabilizers; 50% glycerol
● 适用範圍
短鏈和長(cháng)鏈DNA擴增，特别适合于長(cháng)片段DNA的擴增。
● 使用說明：
1. 按照(zhào)下(xià)表在0.2ml PCR管中制備反應體系：
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成分
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體積
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終濃度
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Template
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0.1-1μg
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as you wish
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Primer 1（10 μM）
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1μl
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200nM
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Primer 2（10 μM）
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1μl
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200nM
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10×Long Taq PCR buffer
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5μl
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1×
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dNTP Mixture(10 mM)
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1μl
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200μM each
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Long Taq (5 U/μl)
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0.5-1μl
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2.5-5U
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ddH2O
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up to 50μl
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-
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2. 混勻後，離心快甩将反應液收集到(dào)管底。
3. PCR儀如果沒有熱蓋加熱的話，補加25μl礦物(wù)油。
4. PCR儀上(shàng)執行以下(xià)程序：
三步法：
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步驟
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溫度
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時間
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循環數
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初始變性
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94℃
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1-5 min
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1
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變性
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94℃
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30 sec
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25-40*
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退火
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Tm-5℃*
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30 sec
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延伸
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72℃
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1 min/kb
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最後延伸
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72℃
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5 min
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1
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兩步法：
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步驟
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溫度
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時間
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循環數
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初始變性
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94℃
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1-5 min
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1
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變性
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94℃
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30 sec
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25-40*
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退火和延伸
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68℃
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1 min/kb
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最後延伸
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72℃
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5 min
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1
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*注： PCR 反應條件(jiàn)視模闆、引物(wù)等的結構條件(jiàn)不同而各異。在實際操作中需根據模闆、目的片段的大小(xiǎo)、堿基序列和引物(wù)的長(cháng)短等具體情況，設定最佳的反應條件(jiàn)（溫度、時間等）。
● 使用舉例：
以λ DNA為(wèi)模闆，配合10×Long Taq PCR buffer，可以很好擴增20kb DNA片段。
以水(shuǐ)稻基因組做模闆，配合10×Long Taq PCR buffer可以很好擴增PEPCase 5.2kb DNA片段。
● 常見(jiàn)問題：
Q1： Long Taq DNA polymerase能(néng)擴增多(duō)長(cháng)片段？
A1：對簡單模闆（如λ噬菌體做模闆），可以擴增20kb片段；對複雜(zá)模闆（如基因組DNA），可以擴增8kb片段。
Q2：Long Taq DNA polymerase保真性怎樣？
A2：Long Taq含有3’-5’校對活性的聚合酶，有校對功能(néng)。保真性為(wèi)普通(tōng)Taq酶的5倍。
Q3： Long Taq DNA polymerase是否隻能(néng)擴增長(cháng)片段？
A3：Long Taq也能(néng)很好的擴增低(dī)于5kb的片段，隻是在長(cháng)片段擴增中更有優勢。
Q4：進行長(cháng)片段PCR時，為(wèi)什麽推薦使用2階段溫度PCR法？
A4：長(cháng)片段PCR擴增時要設計比較長(cháng)的引物(wù)，以增加引物(wù)的特異性，而長(cháng)引物(wù)的Tm比較高(gāo)。在進行長(cháng)片段PCR時，退火溫度和延伸溫度間的差距很小(xiǎo)，當退火溫度超過60℃時，退火溫度和延伸溫度可以設定為(wèi)一(yī)個(gè)溫度，一(yī)般為(wèi)68℃，這樣進行2階段溫度PCR，在長(cháng)片段PCR中能(néng)得到(dào)更好的效果。
Q5：使用Long Taq DNA polymerase的擴增産物(wù)是否可以進行TA克隆？
A5：由于使用Long Taq得到(dào)的PCR産物(wù)大多(duō)數帶有A，可以進行TA克隆。然而，如果想提高(gāo)TA克隆的連接效率，建議加A後再進行TA克隆。
Q6：Long Taq DNA polymerase可以擴增高(gāo)GC含量片段嗎(ma)？
A6：要擴增高(gāo)GC含量片段，建議使用Long Taq配合2×GC buffer使用；不建議使用10×Long Taq buffer。