土(tǔ)壤基因組DNA提取試劑盒
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貨号
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産品名稱
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規格
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RTG2403
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土(tǔ)壤基因組DNA提取試劑盒
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50次
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● 試劑盒内容及保存：
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試劑盒組成
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RTG2403（50次）
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貯存方式
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緩沖液R1
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40
ml
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常溫
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緩沖液R2
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6
ml
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常溫
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緩沖液R3
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6 ml
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常溫
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緩沖液R4
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10
ml
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常溫
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緩沖液 R5（濃縮液）
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15
ml
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常溫
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漂洗緩沖液WB1（濃縮液）
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14
ml
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常溫
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漂洗緩沖液PW (濃縮液)
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13
ml
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常溫
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洗脫液EB
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15
ml
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常溫
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Glass
beads
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20 g
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常溫
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吸附柱CG
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50個(gè)
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常溫
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收集管（2
ml）
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50個(gè)
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常溫
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說明書
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1份
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● 儲存條件(jiàn)和效期：
本試劑盒在室溫（25℃左右）幹燥條件(jiàn)下(xià)，可保存1年(nián)。緩沖液R2和R3可能(néng)有沉澱産生(shēng)，若溶液産生(shēng)沉澱，應在使用前置于37℃下(xià)溶解沉澱至溶液澄清後再使用。
● 産品簡介：
土(tǔ)壤樣品存在大量的抑制因子如腐殖酸、金屬離子等，而純化的DNA 中隻要有這些微量物(wù)質的存在，都會(huì)影響到(dào)PCR等酶促反應。本公司的土(tǔ)壤試劑盒采用獨特的腐殖酸去除液（緩沖液R2）能(néng)夠有效去除腐殖酸；吸附柱CG能(néng)能(néng)有效去除金屬等抑制因子，提純得到(dào)的基因組DNA可直接用于PCR
反應，酶切或定量實驗。
● 準備工(gōng)作：
1. 準備55℃，70℃水(shuǐ)浴；無水(shuǐ)乙醇；異丙醇；制冰機(jī)；1.5ml離心管；2ml離心管
2. 按照(zhào)标簽所示在漂洗緩沖液WB1和漂洗緩沖液PW中加入無水(shuǐ)乙醇；緩沖液R5中加入異丙醇，混勻後蓋緊瓶蓋後室溫貯存備用。
3. 每次使用前請檢查緩沖液R2，緩沖液R3是否有沉澱生(shēng)成，如果出現沉澱，37℃溫浴至沉澱溶解後再使用。
● 标準操作步驟：
如非指出，所有離心步驟均為(wèi)使用台式離心機(jī)在室溫下(xià)離心。
1. 稱0.3-0.5 g土(tǔ)壤置于2ml離心管中，加入0.4gGlass Beads，再加入700 μl 緩沖液R1與100
μl 緩沖液R2。渦旋器(qì)高(gāo)速震蕩3-5min。
注意：對含水(shuǐ)量豐富的樣品，可以預先離心除去部分水(shuǐ)分後再稱取樣品。緩沖液R2是腐殖酸去除劑，100μl對大部分樣品來說足以有效除去腐殖酸等抑制因子。對一(yī)些腐殖酸含量特别豐富的土(tǔ)壤， 緩沖液R2的量可以适當增加，但不能(néng)超過250μl，否則會(huì)嚴重影響DNA的得率。
2. 加入100
μl 緩沖液R3（R3如有沉澱37℃水(shuǐ)浴完全溶解後再用），渦旋混勻。70℃水(shuǐ)浴處理10min。期間振蕩幾次。注意：如果要純化革蘭氏陽性菌的DNA，請在70℃處理完後，再90℃水(shuǐ)浴處理2min。
3. 12000 rpm(~13,000g)離心1分鍾,取600μl上(shàng)清到(dào)1.5ml離心管中，加入180 μl 緩沖液R4混勻。
注：轉移上(shàng)清時确保不要吸取到(dào)沉澱，轉移的上(shàng)清量最好不超過80%。
4. 冰上(shàng)放(fàng)置5分鍾。12000 rpm(~13,000g)離心1分鍾。
轉移上(shàng)清到(dào)新的1.5ml離心管中。
注：轉移上(shàng)清時确保不要吸取到(dào)沉澱，轉移的上(shàng)清量最好不超過80%。
5. 加入與上(shàng)清等體積的緩沖液R5（使用前請檢查是否已加入異丙醇），颠倒混勻。
6. 取750 μl混合液加到(dào)吸附柱中（吸附柱放(fàng)入收集管中），12000 rpm(~13,000g)離心30秒(miǎo)，倒掉濾出液。
7. 将剩餘混合液加到(dào)吸附柱中(吸附柱放(fàng)入收集管中),12000rpm(~13,000g)離心30秒(miǎo),倒掉濾過液。
8. 向吸附柱CG中加入500
μl 漂洗緩沖液WB1(使用前請先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇),12,000
rpm (~13,000×g ) 離心30
秒(miǎo)，倒掉廢液。
9. 向吸附柱CG中加入600
μl 漂洗緩沖液PW(使用前請先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇)，12,000
rpm (~13,000g) 離心30
秒(miǎo)，倒掉廢液，吸附柱CG放(fàng)入收集管中。
10. 向吸附柱CG中加入600
μl漂洗緩沖液PW，12,000
rpm (~13,000g) 離心30秒(miǎo)，倒掉廢液，将吸附柱CG放(fàng)入收集管中。
11. 12,000 rpm(~13,000g)離心2分鍾，以徹底晾幹吸附材料中殘餘的漂洗液。
注：此步驟非常重要，其目的是将吸附柱中殘餘的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響後續的酶反應（酶切、PCR等）實驗。
12. 将吸附柱CG轉入一(yī)個(gè)幹淨的1.5ml離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50–100
μl經70℃水(shuǐ)浴預熱的洗脫緩沖液EB，室溫放(fàng)置2分鍾，12,000 rpm(~13,000g)離心2分鍾。
注: = 1 \* GB3 ① 洗脫緩沖液體積最好不少于50 μl，體積過小(xiǎo)影響回收效率。
= 2 \* GB3 ② 洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水(shuǐ)做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5範圍内，pH值低(dī)于7.0會(huì)降低(dī)洗脫效率。
13.
DNA産物(wù)-20℃保存。
大量操作步驟（針對含微量核酸的樣品）
1. 稱1-5
g土(tǔ)壤置于10ml離心管中，加入1gGlass Beads，再加入3ml
緩沖液R1與200μl
緩沖液R2。渦旋器(qì)高(gāo)速震蕩3-5分鍾。
2.
加入600μl
緩沖液R3，渦旋混勻。70℃水(shuǐ)浴處理10分鍾。期間振蕩幾次。
3.3000g離心3分鍾，轉移上(shàng)清到(dào)新的離心管中，加入550μl
緩沖液R4混勻。
4.
冰上(shàng)放(fàng)置5分鍾。8000
g離心10分鍾。轉移上(shàng)清到(dào)新的離心管中。
5.
以下(xià)按标準操作步驟的第五步繼續操作。
● DNA濃度及純度檢測：
基因組DNA片段的大小(xiǎo)與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。提取的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電(diàn)泳和紫外分光(guāng)光(guāng)度計檢測濃度與純度。可配制0.8-1.0％瓊脂糖凝膠，使用λ/HindIII判斷基因組的大小(xiǎo)，完整的基因組大小(xiǎo)應在23kb以上(shàng)。使用分光(guāng)光(guāng)度計檢測時， OD260/OD280比值應為(wèi)1.7–1.9之間，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水(shuǐ)洗脫，比值可能(néng)偏低(dī)，但并不表明DNA純度不高(gāo)。
● 常見(jiàn)問題分析：
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常見(jiàn)問題
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可能(néng)原因
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建議
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沒有洗脫出DNA
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緩沖液R5沒有加入異丙醇
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樣品過柱前，必須用異丙醇調整核酸結合條件(jiàn)，否則核酸不能(néng)挂柱。
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漂洗緩沖液PW中沒有加入乙醇
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漂洗緩沖液PW使用前請按照(zhào)标簽加入無水(shuǐ)乙醇。無水(shuǐ)乙醇加入量不正确會(huì)導緻核酸提取量大大降低(dī)。
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低(dī)濃度的DNA量
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緩沖液R2使用過量
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按照(zhào)步驟1加入适量緩沖液R2
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洗脫體積太小(xiǎo)
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洗脫體積不能(néng)低(dī)于50μl，如洗脫體積太小(xiǎo)，回收率将大大降低(dī)。
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洗滌不恰當
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漂洗緩沖液PW使用前請按照(zhào)标簽加入無水(shuǐ)乙醇。無水(shuǐ)乙醇加入量不正确會(huì)導緻核酸提取量大大降低(dī)。
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低(dī)A260/A280比率
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蛋白(bái)污染
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不要忽略步驟8中用漂洗緩沖液WB1沖洗吸附柱
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洗脫液pH值不合适
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确保使用的洗脫液pH在8.0以上(shàng)，如低(dī)于8.0将導緻DNA洗脫量過低(dī)。
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下(xià)遊應用不好
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提取的DNA含鹽量高(gāo)
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漂洗緩沖液PW使用前請按照(zhào)标簽加入無水(shuǐ)乙醇。
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提取的DNA含有乙醇
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步驟11空甩柱子2分鍾非常關鍵，徹底去除漂洗液中的乙醇。
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抑制PCR反應
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增加緩沖液R2用量，徹底去除腐殖酸等PCR抑制因子；步驟4中确保不要吸取到(dào)沉澱。
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實驗示例：
Buffer R2去除腐殖酸效果對比圖
左圖-步驟1提取時使用了Brffer R2，顔色明顯淺很多(duō)(左1,左2)，
說明Buffer R2對去除腐殖酸、色素等效果明顯
右圖-步驟3上(shàng)清加入Buffer R4進一(yī)步處理，離心去除雜(zá)質，
裂解時加有Buffer R2的，再經Buffer R4處理幾乎不再有顔色(右1,右2)，
而不加Buffer R2的顔色還(hái)很深(右3，右4)。
1, 2: SDS高(gāo)鹽酚氯仿抽提法
3, 4: 土(tǔ)壤基因組DNA提取試劑盒(RTG2403)提取
1, 3: 為(wèi)花基土(tǔ)壤
2, 4: 河邊淤泥
核酸提取産品發表文章
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