EMSA PAGE凝膠配制試劑盒
PAGE
Electrophoresis Kit for EMSA
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貨号
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名稱
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規格
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RTE4104
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EMSA PAGE凝膠配制試劑盒
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30-60次
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● 産品組成：
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貨号
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名稱
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規格
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貯存
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RTE4104-01
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40%PAA(37.5:1)
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50 ml
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4℃，避光(guāng)
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RTE4104-02
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5×TBE
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50 ml
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RT
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RTE4104-03
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80%甘油
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20 ml
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RT
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AP020P
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APS（幹粉）
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5 ml
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RT（配制後-20℃貯存）
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TA0761-01
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TEMED
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0.5 ml
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4℃，避光(guāng)
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● 産品簡介：
EMSA PAGE凝膠配制試劑盒(PAGE Gel Preparation Kit for PAGE)提供了配制EMSA PAGE凝膠所需的各種試劑，用戶隻需自(zì)備制膠器(qì)具和蒸餾水(shuǐ)，即可配制不同濃度的EMSA PAGE凝膠。凝膠遷移實驗(也稱凝膠阻滞實驗或電(diàn)泳遷移率實驗)
(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)，也稱Gel Shift，是一(yī)種用于研究蛋白(bái)與核酸相(xiàng)互作用的高(gāo)靈敏實驗技(jì)術(shù)。主要用于轉錄因子與啓動子相(xiàng)互作用的驗證性實驗，也可應用于蛋白(bái)與DNA、蛋白(bái)與RNA相(xiàng)互作用研究。EMSA技(jì)術(shù)基于進行非變性聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電(diàn)泳時，蛋白(bái)質與DNA或RNA複合物(wù)的遷移速度比遊離線性DNA或RNA片段慢(màn)，從(cóng)而導緻DNA或RNA遷移位置在與蛋白(bái)質結合時滞後。
本試劑盒大約可以配制30-50塊常規大小(xiǎo)（8×10 cm）PAGE凝膠，具體數量根據凝膠厚度決定：0.75mm厚度凝膠可以配制60塊膠，1 mm厚度凝膠可以配制45塊膠，1.5 mm厚度凝膠可以配制30塊膠。
● 貯存和效期：
本産品常溫運輸；按照(zhào)标簽溫度貯存；有效期一(yī)年(nián)。
● 使用說明：
10% APS配制-5 ml：
将0.5 gAPS幹粉溶于5 ml滅菌水(shuǐ)中，徹底溶解後分裝，1 ml/支，-20℃備存，每次取一(yī)管使用。10% APS應盡量減少常溫存放(fàng)時間，以防失效，若發現凝膠聚合時間延長(cháng)，應考慮更換使用-20度保存的10% APS。
一(yī)、制備凝膠步驟：
1.1 參照(zhào)凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。
1.2按照(zhào)表格将不同體積的成分在小(xiǎo)燒杯中混合；最後加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。配制一(yī)塊常用EMSA PAGE膠(8×10 cm)所需凝膠溶液體積：0.75 mm厚度凝膠約5 ml；1 mm厚度凝膠約7 ml；1.5 mm厚度凝膠約10 ml。均含約0.5 ml的餘量。
EMSA PAGE凝膠配方表一(yī) (0.75 m厚度凝膠)：
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總體積5 ml，适用于厚度0.75 mm小(xiǎo)闆膠
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各組份體積（ml）
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膠濃度
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滅菌水(shuǐ)
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40%PAA(37.5:1)
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80%甘油
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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3.8
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0.5
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0.156
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0.5
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0.05
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0.005
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5%
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3.66
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0.625
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0.156
|
0.5
|
0.05
|
0.005
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6%
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3.54
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0.75
|
0.156
|
0.5
|
0.05
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0.005
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EMSA PAGE凝膠配方表二 (1.0 mm厚度凝膠)：
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總體積7 ml，适用于厚度1 mm小(xiǎo)闆膠
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各組份體積（ml）
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膠濃度
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滅菌水(shuǐ)
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40%PAA(37.5:1)
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80%甘油
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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5.3
|
0.7
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0.22
|
0.7
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0.07
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0.007
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5%
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5.2
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0.875
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0.22
|
0.7
|
0.07
|
0.007
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6%
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5.0
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1.05
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0.22
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0.7
|
0.07
|
0.007
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EMSA PAGE凝膠配方表三 (1.5 mm厚度凝膠)：
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總體積10 ml，适用于厚度1.5 mm小(xiǎo)闆膠
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各組份體積（ml）
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膠濃度
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滅菌水(shuǐ)
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40%PAA(37.5:1)
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80%甘油
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5×TBE
|
10%APS
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TEMED
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4%
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7.6
|
1
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0.313
|
1
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0.1
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0.01
|
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5%
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7.4
|
1.25
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0.313
|
1
|
0.1
|
0.01
|
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6%
|
7.1
|
1.5
|
0.313
|
1
|
0.1
|
0.01
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1.3在玻璃闆中灌入凝膠溶液至玻璃闆頂端，插入梳子，避免産生(shēng)氣泡。
1.4靜(jìng)置20-60分鍾，等待凝膠完全聚合。
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環境溫度
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凝固時間
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低(dī)于18度
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＞60分鍾
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18度
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~40分鍾
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25度
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~30分鍾
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高(gāo)于25度
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~20分鍾
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注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高(gāo)時，聚合較快；冬天氣溫低(dī)時，聚合時間會(huì)延長(cháng)。可以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。
二、電(diàn)泳：
2.1預電(diàn)泳：拔出梳子，用0.5×TBE緩沖液徹底沖洗加樣孔2-3次。電(diàn)泳槽内外加入适量0.5×TBE緩沖液，穩壓100 V預電(diàn)泳10分鍾。
注：試劑盒配套的5×TBE緩沖液僅夠配制凝膠用，0.5×TBE電(diàn)泳緩沖液請自(zì)己制備，配方如下(xià)：
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終濃度
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順序
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原料
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1升
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5 升
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44.5 mM
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1
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Tris堿 [MW121.14]
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5.4 克
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27克
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1 mM
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2
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EDTA 2Na·2H2O [MW372.24]
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0.372 克
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1.86克
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44.5 MM
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3
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硼酸 [MW61.83]
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2.75 克
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13.75克
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4
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超純水(shuǐ)最後定容至
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1 升
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5 升
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最後pH在8.2-8.3之間，可以不用調節pH，記錄每批pH
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2.2 把混合了無色上(shàng)樣緩沖液的樣品加入到(dào)上(shàng)樣孔内。在多(duō)餘的某個(gè)上(shàng)樣孔内加入10 μl稀釋好的1X的EMSA 上(shàng)樣緩沖液(藍色)，用于觀察電(diàn)泳進行的情況。
2.3 穩壓100 V電(diàn)泳，可以冰浴或4度條件(jiàn)下(xià)電(diàn)泳，确保膠的溫度不超過30℃。電(diàn)泳至上(shàng)樣緩沖液中的藍色染料溴酚藍至膠的下(xià)緣1/4處，停止電(diàn)泳。