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DNA非變性PAGE電(diàn)泳試劑盒

DNA非變性PAGE電(diàn)泳試劑盒

産品編号:RTE4101

産品規格:45闆 0.75mm膠

數量
價格 ¥450

 TBE-PAGE電(diàn)泳可以選擇PAGE電(diàn)泳Marker 作為(wèi)分子量标準。                   


                  DNA非變性PAGE電(diàn)泳試劑盒(貨号RTE4101  

                       DNA Native PAGE Electrophoresis Kit

産品組成:

貨号

名稱

規格

保存條件(jiàn)

AC2913-01

30%PAA(29:1)

100 ml

4

TB001

5×TBE

500 ml

RT

AP020P

APS(幹粉)

5 ml

RT配制後-20貯存

TA0761-01

TEMED

0.5 ml

4,避光(guāng)

DL070

6×Native-PAGE DNA上(shàng)樣緩沖液

1 ml

4

産品簡介:

非變性 PAGE 電(diàn)泳是研究DNA構象變化的常用手段,在非變性條件(jiàn)下(xià)DNA的泳動與電(diàn)荷、片段大小(xiǎo)、DNA結合的蛋白(bái)及折疊構象都有關系。非變性PAGE電(diàn)泳是研究單鏈 PCR片段構象多(duō)态性(SSCP-PCR,single-strand conformation  polymorphism-PCR)的重要研究手段。在SSCP測定中,雙鏈DNA(dsDNA)變性為(wèi)單鏈DNA(ssDNA),每一(yī)條單鏈DNA都基于他們的内部序列呈現不同的折疊構象,即使相(xiàng)同長(cháng)度的單鏈DNA因其堿基順序不同,甚至單個(gè)堿基的不同都會(huì)形成不同的構象。這些不同構象的ssDNA 在非變性PAGE中得到(dào)分離。另外,非變性PAGE還(hái)可以分離小(xiǎo)片段的雙鏈DNA,與瓊脂糖電(diàn)泳相(xiàng)比,對低(dī)于500bp的雙鏈DNA片段有更優秀的分辨率。

本公司提供的DNA非變性PAGE電(diàn)泳試劑盒包含凝膠制備及電(diàn)泳所需的全部試劑,用戶隻需自(zì)備制膠器(qì)具和蒸餾水(shuǐ),即可配制各種濃度的PAGE膠,使用方便。

本試劑盒大約可以配制20-45塊常規大小(xiǎo)(8×10cm)PAGE凝膠,具體數量根據凝膠厚度決定:0.75mm厚度凝膠可以配制45塊膠,1mm厚度凝膠可以配制至少35塊膠,1.5mm厚度凝膠可以配制至少20塊膠。

貯存和效期:

   本産品常溫運輸,按照(zhào)标簽溫度貯存;有效期一(yī)年(nián)。

使用說明:

10% APS配制-5 ml

将0.5 gAPS幹粉溶于5 ml滅菌水(shuǐ)中,徹底溶解後分裝,1 ml/支,-20℃備存,每次取一(yī)管使用。10% APS應盡量減少室溫存放(fàng)時間,以防失效。10%APS在4℃有效期為(wèi)一(yī)周,-20℃有效期6個(gè)月(yuè)。若發現凝膠聚合時間延長(cháng),應考慮更換使用-20度保存的10% APS。

一(yī)、制備凝膠步驟:(以下(xià)步驟為(wèi)制備8×10cm厚度1.0mm膠)

1.1 參照(zhào)凝膠模具說明書,裝配好凝膠模具。

1.2按照(zhào)表一(yī)将不同體積的成分在小(xiǎo)燒杯或試管中混合;最後加入10%APS和TEMED,輕輕攪拌使其混勻,避免産生(shēng)氣泡。

1.3在凝膠模具中灌入适量分離膠溶液(對于mini-gel,凝膠液加至約距前玻璃闆頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可),然後在分離膠溶液上(shàng)輕輕覆蓋一(yī)層1-5 cm的水(shuǐ)層,使凝膠表面保持平整。

1.4靜(jìng)置10-20分鍾,待分離膠和水(shuǐ)層之間出現一(yī)個(gè)清晰的界面後,說明凝膠已聚合

表一(yī) TBE-PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml,适用于厚度1.0 mm小(xiǎo)闆膠)

各組份體積(ml

最佳DNA分離範圍

凝膠濃度

滅菌水(shuǐ)

30%PAA291

5×TBE

10%APS

TEMED

70-450 bp

6%

3

1.0

1.0

0.05

0.005

60-460 bp

8%

2.66

1.34

1.0

0.05

0.005

50-300 bp

10%

2.33

1.67

1.0

0.05

0.005

40-200 bp

12%

2

2.0

1.0

0.05

0.005

25-150 bp

15%

1.5

2.5

1.0

0.05

0.005

5-100 bp

20%

0.66

3.34

1.0

0.05

0.005

注:凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高(gāo)時,聚合較快;冬天氣溫低(dī)時,聚合時間會(huì)延長(cháng)。可以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。

1.5去除覆蓋在分離膠上(shàng)的水(shuǐ)層;按照(zhào)表二将不同體積成分在一(yī)個(gè)小(xiǎo)燒杯或試管中混合;最後加入10%過硫酸铵和TEMED,輕輕攪拌使其混勻,避免産生(shēng)氣泡。

表二 TBE-PAGE 4%濃縮配方表 (總體積1.5 ml,适用于1.0mm厚度膠)

各組份體積(ml

凝膠濃度

滅菌水(shuǐ)

30%PAA291

5×TBE

10%APS

TEMED

4%

1.0

0.2

0.3

0.02

0.002

1.6将濃縮膠溶液加至分離膠的上(shàng)面,直至凝膠溶液到(dào)達前玻璃闆的頂端;将梳子插入凝膠内,避免産生(shēng)氣泡。

1.7靜(jìng)置30-60分鍾,等待濃縮膠聚合。

注:凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高(gāo)時,聚合較快;冬天氣溫低(dī)時,聚合時間會(huì)延長(cháng)。可以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。

二、電(diàn)泳:

2.1 1×TBE電(diàn)泳液配制:取100ml 5×TBE,加蒸餾水(shuǐ)400 ml,即配成500 ml 1×TBE。将凝膠闆固定在電(diàn)泳裝置上(shàng),往上(shàng)槽和下(xià)槽中加入足夠1×TBE電(diàn)泳液。 用1ml吸頭沖洗加樣孔1-2次。

2.2 取待測樣品,加入相(xiàng)應體積6×Native PAGE DNA上(shàng)樣液,如5 μl樣品加1 μl 上(shàng)樣液,短暫離

心後取5-10 μl上(shàng)樣。TBE-PAGE中判斷雙鏈DNA大小(xiǎo)可以選擇20bp DNA ladder(貨号:RTM441)作為(wèi)DNA Marker。

2.3 連接電(diàn)源線,打開(kāi)電(diàn)源開(kāi)關。200 V穩壓電(diàn)泳。至二甲苯菁指示前沿到(dào)達凝膠三分之二位置時結束電(diàn)泳。

TBE-PAGE電(diàn)泳

恒電(diàn)壓

起始電(diàn)流

結束電(diàn)流

電(diàn)泳時間

200 V

20-25 mA/闆膠

10-15 mA/闆膠

70+min


三、染色:

3.1 漂洗:玻璃闆上(shàng)拆下(xià)凝膠後,适量蒸餾水(shuǐ)漂洗3-5分鍾。

3.2 染色液配制:

  TBE-PAGE膠可以使用EBRealSafe類染料後染染色,以下(xià)程序用RealSafe Red核酸染料進行染色。即用型染色液配制:

 

即用型RealSafe核酸染色液

 

100 ml

1×TBE

100 ml

RealSafe Red核酸染料

20 μl

3.3染色:

  凝膠浸泡于即用型染色液中,常溫避光(guāng)搖床40-60rpm染色30 分鍾。


五、常見(jiàn)問題:

1. 為(wèi)何 SSCP-PCR帶型有複合條帶?

原因之一(yī):可能(néng)是殘留的 PCR 引物(wù)跟單鏈的 DNA 結合形成遷移率不同的條帶。解決方法是稀釋PCR或電(diàn)泳前将PCR産物(wù)進行純化。

原因之二:可能(néng)是PCR産物(wù)用量過高(gāo),彼此複性。解決辦法是将PCR産物(wù)稀釋後4-8倍後使用。 

2. 如何提高(gāo)電(diàn)泳分辨率?

可以在配膠時加入甘油(終濃度為(wèi)5%-10%),因為(wèi)甘油是弱變性劑,能(néng)部分展開(kāi) DNA 折疊結構,增加表面積,增加電(diàn)泳時位移差異。但加入甘油後粘性變大,電(diàn)泳速度變慢(màn),因此隻适合常溫電(diàn)泳使用,不要4℃電(diàn)泳。如果條件(jiàn)允許,最好同時做加甘油和不加甘油的電(diàn)泳實驗。


實驗示例



使用RTE4101 DNA非變性PAGE電(diàn)泳試劑盒産品發表部分文章列表:

1. [2022 IF=6] A novel ?uorescent sensor based on aptamer recognition and DNA walker ampli?cation strategy and its determination of 17b-estradiol.

Author: Yajun Zhang, Licong Jia, Wei Wang, Meng Jiang, Hongying Zhang, LingMei Niu

Marker: RTE4101 DNA非變性PAGE電(diàn)泳試劑盒

Journal: Arabian Journal of Chemistry. 16 (2023) 105340.

Institution:School of Public Health, Hebei Medical University

Paper linkhttps://doi.org/10.1016/j.arabjc.2023.105340


 
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