TBE-PAGE電(diàn)泳可以選擇PAGE電(diàn)泳Marker 作為(wèi)分子量标準。                   

                  DNA非變性PAGE電(diàn)泳試劑盒（貨号RTE4101）  

                       DNA Native PAGE Electrophoresis Kit

● 産品組成：

● 産品簡介：

非變性 PAGE 電(diàn)泳是研究DNA構象變化的常用手段，在非變性條件(jiàn)下(xià)DNA的泳動與電(diàn)荷、片段大小(xiǎo)、DNA結合的蛋白(bái)及折疊構象都有關系。非變性PAGE電(diàn)泳是研究單鏈 PCR片段構象多(duō)态性（SSCP-PCR，single-strand conformation  polymorphism-PCR）的重要研究手段。在SSCP測定中，雙鏈DNA（dsDNA）變性為(wèi)單鏈DNA（ssDNA），每一(yī)條單鏈DNA都基于他們的内部序列呈現不同的折疊構象，即使相(xiàng)同長(cháng)度的單鏈DNA因其堿基順序不同，甚至單個(gè)堿基的不同都會(huì)形成不同的構象。這些不同構象的ssDNA 在非變性PAGE中得到(dào)分離。另外，非變性PAGE還(hái)可以分離小(xiǎo)片段的雙鏈DNA，與瓊脂糖電(diàn)泳相(xiàng)比，對低(dī)于500bp的雙鏈DNA片段有更優秀的分辨率。

本公司提供的DNA非變性PAGE電(diàn)泳試劑盒包含凝膠制備及電(diàn)泳所需的全部試劑，用戶隻需自(zì)備制膠器(qì)具和蒸餾水(shuǐ)，即可配制各種濃度的PAGE膠，使用方便。

本試劑盒大約可以配制20-45塊常規大小(xiǎo)（8×10cm）PAGE凝膠，具體數量根據凝膠厚度決定：0.75mm厚度凝膠可以配制45塊膠，1mm厚度凝膠可以配制至少35塊膠，1.5mm厚度凝膠可以配制至少20塊膠。

● 貯存和效期：

   本産品常溫運輸，按照(zhào)标簽溫度貯存；有效期一(yī)年(nián)。

● 使用說明：

10% APS配制-5 ml：

将0.5 gAPS幹粉溶于5 ml滅菌水(shuǐ)中，徹底溶解後分裝，1 ml/支，-20℃備存，每次取一(yī)管使用。10% APS應盡量減少室溫存放(fàng)時間，以防失效。10%APS在4℃有效期為(wèi)一(yī)周，-20℃有效期6個(gè)月(yuè)。若發現凝膠聚合時間延長(cháng)，應考慮更換使用-20度保存的10% APS。

一(yī)、制備凝膠步驟：（以下(xià)步驟為(wèi)制備8×10cm厚度1.0mm膠）

1.1 參照(zhào)凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。

1.2按照(zhào)表一(yī)将不同體積的成分在小(xiǎo)燒杯或試管中混合；最後加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。

1.3在凝膠模具中灌入适量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃闆頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然後在分離膠溶液上(shàng)輕輕覆蓋一(yī)層1-5 cm的水(shuǐ)層，使凝膠表面保持平整。

1.4靜(jìng)置10-20分鍾，待分離膠和水(shuǐ)層之間出現一(yī)個(gè)清晰的界面後，說明凝膠已聚合

表一(yī) TBE-PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，适用于厚度1.0 mm小(xiǎo)闆膠)

注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高(gāo)時，聚合較快；冬天氣溫低(dī)時，聚合時間會(huì)延長(cháng)。可以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。

1.5去除覆蓋在分離膠上(shàng)的水(shuǐ)層；按照(zhào)表二将不同體積成分在一(yī)個(gè)小(xiǎo)燒杯或試管中混合；最後加入10%過硫酸铵和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。

表二 TBE-PAGE 4%濃縮配方表 (總體積1.5 ml，适用于1.0mm厚度膠)

1.6将濃縮膠溶液加至分離膠的上(shàng)面，直至凝膠溶液到(dào)達前玻璃闆的頂端；将梳子插入凝膠内，避免産生(shēng)氣泡。

1.7靜(jìng)置30-60分鍾，等待濃縮膠聚合。

注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高(gāo)時，聚合較快；冬天氣溫低(dī)時，聚合時間會(huì)延長(cháng)。可以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。

二、電(diàn)泳：

2.1 1×TBE電(diàn)泳液配制：取100ml 5×TBE，加蒸餾水(shuǐ)400 ml，即配成500 ml 1×TBE。将凝膠闆固定在電(diàn)泳裝置上(shàng)，往上(shàng)槽和下(xià)槽中加入足夠1×TBE電(diàn)泳液。 用1ml吸頭沖洗加樣孔1-2次。

2.2 取待測樣品，加入相(xiàng)應體積6×Native PAGE DNA上(shàng)樣液，如5 μl樣品加1 μl 上(shàng)樣液，短暫離

心後取5-10 μl上(shàng)樣。TBE-PAGE中判斷雙鏈DNA大小(xiǎo)可以選擇20bp DNA ladder（貨号：RTM441）作為(wèi)DNA Marker。

2.3 連接電(diàn)源線，打開(kāi)電(diàn)源開(kāi)關。200 V穩壓電(diàn)泳。至二甲苯菁指示前沿到(dào)達凝膠三分之二位置時結束電(diàn)泳。

三、染色：

3.1 漂洗：玻璃闆上(shàng)拆下(xià)凝膠後，适量蒸餾水(shuǐ)漂洗3-5分鍾。

3.2 染色液配制：

  TBE-PAGE膠可以使用EB或RealSafe類染料後染染色，以下(xià)程序用RealSafe Red核酸染料進行染色。即用型染色液配制：

3.3染色：

五、常見(jiàn)問題：

1. 為(wèi)何 SSCP-PCR帶型有複合條帶？

原因之一(yī)：可能(néng)是殘留的 PCR 引物(wù)跟單鏈的 DNA 結合形成遷移率不同的條帶。解決方法是稀釋PCR或電(diàn)泳前将PCR産物(wù)進行純化。

原因之二：可能(néng)是PCR産物(wù)用量過高(gāo)，彼此複性。解決辦法是将PCR産物(wù)稀釋後4-8倍後使用。 

2. 如何提高(gāo)電(diàn)泳分辨率？

實驗示例