TBE-PAGE電(diàn)泳可以選擇PAGE電(diàn)泳Marker 作為(wèi)分子量标準。
DNA非變性PAGE電(diàn)泳試劑盒(貨号RTE4101)
DNA Native PAGE
Electrophoresis Kit
● 産品組成:
貨号
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名稱
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規格
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保存條件(jiàn)
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AC2913-01
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30%PAA(29:1)
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100 ml
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4℃
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TB001
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5×TBE
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500 ml
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RT
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AP020P
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APS(幹粉)
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5 ml
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RT(配制後-20℃貯存)
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TA0761-01
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TEMED
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0.5 ml
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4℃,避光(guāng)
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DL070
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6×Native-PAGE DNA上(shàng)樣緩沖液
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1 ml
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4℃
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● 産品簡介:
非變性 PAGE 電(diàn)泳是研究DNA構象變化的常用手段,在非變性條件(jiàn)下(xià)DNA的泳動與電(diàn)荷、片段大小(xiǎo)、DNA結合的蛋白(bái)及折疊構象都有關系。非變性PAGE電(diàn)泳是研究單鏈 PCR片段構象多(duō)态性(SSCP-PCR,single-strand conformation polymorphism-PCR)的重要研究手段。在SSCP測定中,雙鏈DNA(dsDNA)變性為(wèi)單鏈DNA(ssDNA),每一(yī)條單鏈DNA都基于他們的内部序列呈現不同的折疊構象,即使相(xiàng)同長(cháng)度的單鏈DNA因其堿基順序不同,甚至單個(gè)堿基的不同都會(huì)形成不同的構象。這些不同構象的ssDNA 在非變性PAGE中得到(dào)分離。另外,非變性PAGE還(hái)可以分離小(xiǎo)片段的雙鏈DNA,與瓊脂糖電(diàn)泳相(xiàng)比,對低(dī)于500bp的雙鏈DNA片段有更優秀的分辨率。
本公司提供的DNA非變性PAGE電(diàn)泳試劑盒包含凝膠制備及電(diàn)泳所需的全部試劑,用戶隻需自(zì)備制膠器(qì)具和蒸餾水(shuǐ),即可配制各種濃度的PAGE膠,使用方便。
本試劑盒大約可以配制20-45塊常規大小(xiǎo)(8×10cm)PAGE凝膠,具體數量根據凝膠厚度決定:0.75mm厚度凝膠可以配制45塊膠,1mm厚度凝膠可以配制至少35塊膠,1.5mm厚度凝膠可以配制至少20塊膠。
● 貯存和效期:
本産品常溫運輸,按照(zhào)标簽溫度貯存;有效期一(yī)年(nián)。
● 使用說明:
10% APS配制-5 ml:
将0.5 gAPS幹粉溶于5 ml滅菌水(shuǐ)中,徹底溶解後分裝,1 ml/支,-20℃備存,每次取一(yī)管使用。10% APS應盡量減少室溫存放(fàng)時間,以防失效。10%APS在4℃有效期為(wèi)一(yī)周,-20℃有效期6個(gè)月(yuè)。若發現凝膠聚合時間延長(cháng),應考慮更換使用-20度保存的10% APS。
一(yī)、制備凝膠步驟:(以下(xià)步驟為(wèi)制備8×10cm厚度1.0mm膠)
1.1 參照(zhào)凝膠模具說明書,裝配好凝膠模具。
1.2按照(zhào)表一(yī)将不同體積的成分在小(xiǎo)燒杯或試管中混合;最後加入10%APS和TEMED,輕輕攪拌使其混勻,避免産生(shēng)氣泡。
1.3在凝膠模具中灌入适量分離膠溶液(對于mini-gel,凝膠液加至約距前玻璃闆頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可),然後在分離膠溶液上(shàng)輕輕覆蓋一(yī)層1-5
cm的水(shuǐ)層,使凝膠表面保持平整。
1.4靜(jìng)置10-20分鍾,待分離膠和水(shuǐ)層之間出現一(yī)個(gè)清晰的界面後,說明凝膠已聚合
表一(yī) TBE-PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml,适用于厚度1.0 mm小(xiǎo)闆膠)
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各組份體積(ml)
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最佳DNA分離範圍
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凝膠濃度
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滅菌水(shuǐ)
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30%PAA(29:1)
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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70-450 bp
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6%
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3
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1.0
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1.0
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0.05
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0.005
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60-460 bp
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8%
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2.66
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1.34
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1.0
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0.05
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0.005
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50-300 bp
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10%
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2.33
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1.67
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1.0
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0.05
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0.005
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40-200 bp
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12%
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2
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2.0
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1.0
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0.05
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0.005
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25-150 bp
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15%
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1.5
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2.5
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1.0
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0.05
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0.005
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5-100 bp
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20%
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0.66
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3.34
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1.0
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0.05
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0.005
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注:凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高(gāo)時,聚合較快;冬天氣溫低(dī)時,聚合時間會(huì)延長(cháng)。可以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。
1.5去除覆蓋在分離膠上(shàng)的水(shuǐ)層;按照(zhào)表二将不同體積成分在一(yī)個(gè)小(xiǎo)燒杯或試管中混合;最後加入10%過硫酸铵和TEMED,輕輕攪拌使其混勻,避免産生(shēng)氣泡。
表二 TBE-PAGE 4%濃縮配方表 (總體積1.5 ml,适用于1.0mm厚度膠)
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各組份體積(ml)
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凝膠濃度
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滅菌水(shuǐ)
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30%PAA(29:1)
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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1.0
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0.2
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0.3
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0.02
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0.002
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1.6将濃縮膠溶液加至分離膠的上(shàng)面,直至凝膠溶液到(dào)達前玻璃闆的頂端;将梳子插入凝膠内,避免産生(shēng)氣泡。
1.7靜(jìng)置30-60分鍾,等待濃縮膠聚合。
注:凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高(gāo)時,聚合較快;冬天氣溫低(dī)時,聚合時間會(huì)延長(cháng)。可以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。
二、電(diàn)泳:
2.1 1×TBE電(diàn)泳液配制:取100ml 5×TBE,加蒸餾水(shuǐ)400 ml,即配成500
ml 1×TBE。将凝膠闆固定在電(diàn)泳裝置上(shàng),往上(shàng)槽和下(xià)槽中加入足夠1×TBE電(diàn)泳液。 用1ml吸頭沖洗加樣孔1-2次。
2.2 取待測樣品,加入相(xiàng)應體積6×Native PAGE DNA上(shàng)樣液,如5 μl樣品加1 μl 上(shàng)樣液,短暫離
心後取5-10 μl上(shàng)樣。TBE-PAGE中判斷雙鏈DNA大小(xiǎo)可以選擇20bp
DNA ladder(貨号:RTM441)作為(wèi)DNA Marker。
2.3 連接電(diàn)源線,打開(kāi)電(diàn)源開(kāi)關。200 V穩壓電(diàn)泳。至二甲苯菁指示前沿到(dào)達凝膠三分之二位置時結束電(diàn)泳。
TBE-PAGE電(diàn)泳
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恒電(diàn)壓
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起始電(diàn)流
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結束電(diàn)流
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電(diàn)泳時間
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200
V
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20-25 mA/闆膠
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10-15
mA/闆膠
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70+min
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3.1 漂洗:玻璃闆上(shàng)拆下(xià)凝膠後,适量蒸餾水(shuǐ)漂洗3-5分鍾。
3.2 染色液配制:
TBE-PAGE膠可以使用EB或RealSafe類染料後染染色,以下(xià)程序用RealSafe Red核酸染料進行染色。即用型染色液配制:
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即用型RealSafe核酸染色液
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100 ml
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1×TBE
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100 ml
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RealSafe Red核酸染料
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20 μl
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3.3染色:
凝膠浸泡于即用型染色液中,常溫避光(guāng)搖床40-60rpm染色30 分鍾。
五、常見(jiàn)問題:
1. 為(wèi)何 SSCP-PCR帶型有複合條帶?
原因之一(yī):可能(néng)是殘留的 PCR 引物(wù)跟單鏈的 DNA 結合形成遷移率不同的條帶。解決方法是稀釋PCR或電(diàn)泳前将PCR産物(wù)進行純化。
原因之二:可能(néng)是PCR産物(wù)用量過高(gāo),彼此複性。解決辦法是将PCR産物(wù)稀釋後4-8倍後使用。
2. 如何提高(gāo)電(diàn)泳分辨率?
可以在配膠時加入甘油(終濃度為(wèi)5%-10%),因為(wèi)甘油是弱變性劑,能(néng)部分展開(kāi) DNA 折疊結構,增加表面積,增加電(diàn)泳時位移差異。但加入甘油後粘性變大,電(diàn)泳速度變慢(màn),因此隻适合常溫電(diàn)泳使用,不要4℃電(diàn)泳。如果條件(jiàn)允許,最好同時做加甘油和不加甘油的電(diàn)泳實驗。
實驗示例
使用RTE4101 DNA非變性PAGE電(diàn)泳試劑盒産品發表部分文章列表:
1. [2022 IF=6] A novel ?uorescent sensor
based on aptamer recognition and DNA walker ampli?cation strategy and its
determination of 17b-estradiol.
Author: Yajun Zhang, Licong Jia, Wei Wang,
Meng Jiang, Hongying Zhang, LingMei Niu
Marker: RTE4101 DNA非變性PAGE電(diàn)泳試劑盒
Journal: Arabian Journal of Chemistry. 16
(2023) 105340.
Institution:School of Public Health, Hebei Medical
University
Paper link:https://doi.org/10.1016/j.arabjc.2023.105340