柱式動物(wù)總蛋白(bái)提取試劑盒（細胞樣品，變性提取）
Column Animal Cells Denaturing Total Protein
Extraction Kit Ver.740164
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貨号
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産品名稱
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規格
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RTD8302
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柱式動物(wù)總蛋白(bái)提取試劑盒（細胞樣品，變性提取）
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50次
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● 産品包裝：
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貨号
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組份
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規格
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貯存
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RTD8302-01
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變性裂解緩沖液
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25 ml
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4℃
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CD-50
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離心柱套裝
（包含離心柱和2 ml連蓋收集管）
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50套
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RT
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● 産品簡介：
本試劑盒可從(cóng)動物(wù)懸浮細胞或貼壁細胞中提取總蛋白(bái)，用變性裂解緩沖液配合離心柱裂解細胞，無需超聲處理打斷DNA，提取過程簡便高(gāo)效，大約10分鍾即可完成蛋白(bái)提取，可以提取到(dào)細胞内的絕大多(duō)數蛋白(bái)質（包括膜，細胞器(qì)，核，核基質和胞質蛋白(bái)）。獲得的總蛋白(bái)可用于SDS-PAGE
Western Blot檢測、免疫沉澱（IP）等後續研究。由于裂解緩沖液中含有SDS等強變性劑，不建議用于免疫共沉澱（Co-IP）、EMSA以及酶活性分析等與蛋白(bái)活性相(xiàng)關的實驗。
按照(zhào)每次使用~5×106培養細胞加0.5 ml裂解緩沖液計算(suàn)，本試劑盒大約可以使用50 次。
● 保存、效期及運輸：
按照(zhào)标簽溫度貯存，有效期一(yī)年(nián)，試劑盒常溫運輸。
● 用前必讀(dú)：
1.
離心機(jī)請調整成RCF/g模式，按照(zhào)離心力設置離心機(jī)（不要根據轉速rpm模式設置），所有離心步驟都需要在4℃低(dī)溫離心機(jī)中進行。
2.
溶液混勻後放(fàng)置于冰上(shàng)。将離心柱套裝蓋好管蓋，放(fàng)置于冰上(shàng)預冷。
3.
蛋白(bái)提取推薦添加蛋白(bái)酶抑制劑（自(zì)備，試劑盒不提供），根據蛋白(bái)酶抑制劑母液濃度提前添加在裂解緩沖液中（添加時按照(zhào)1:100添加，即1
ml裂解緩沖液 添加10
μl抑制劑）；研究蛋白(bái)磷酸化，需要添加磷酸酶抑制劑（自(zì)備，試劑盒不提供）。
4.
蛋白(bái)定量推薦使用BCA方法，可以選擇BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒（貨号：RTP7102）。
● 使用說明：
一(yī). 準備即用型裂解緩沖液：
取适當體積的預冷裂解緩沖液，在使用前數分鍾内加入1/100體積的蛋白(bái)酶抑制劑（100×）（自(zì)備，試劑盒不提供），如果進行蛋白(bái)磷酸化研究，需要加入1/100體積的磷酸酶抑制劑（100×）（自(zì)備，試劑盒不提供），随後立即放(fàng)于冰上(shàng)待用。
二. 貼壁細胞蛋白(bái)提取：
2.1 将預冷的 1×PBS直接加入培養闆，培養皿或培養瓶中清洗貼壁細胞，吸去上(shàng)清。
2. 2 按照(zhào)下(xià)表中将相(xiàng)應體積的變性裂解緩沖液均勻的加入整個(gè)器(qì)皿表面，用移液器(qì)吹打混勻，冰浴5分鍾。
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細胞類型
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培養器(qì)皿
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細胞數量
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細胞沉澱體積（PCV）（μl）
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裂解緩沖液（μl）
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貼壁細胞
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24孔闆
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~5×105
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~5
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50
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6孔闆
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~2.5×106
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~25
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200
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25cm2培養瓶
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~2×106
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~20
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200
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75cm2培養瓶
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~8×106
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~80
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500
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35
mm培養皿
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~2×106
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~20
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200
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60
mm培養皿
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~5×106
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~50
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500
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100
mm培養皿
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~1.5×107
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調整細胞數目到(dào)2-5×106
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200
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注： (二百萬，2×106)HeLa細胞，其細胞沉澱體積（PCV，Packed Cell Volume）大約為(wèi)20 μl。
2. 3 将裂解的細胞轉移到(dào)預冷的離心柱中，4℃ 16000g 離心 1分鍾。
注：裂解中細胞會(huì)釋放(fàng)出變性的核酸，呈團狀粘稠透明樣，如移液器(qì)不易吸取，可以将吸頭剪尖，保證将全部裂解物(wù)加到(dào)離心柱中。
2. 4 棄去離心柱，将收集管中蛋白(bái)溶液轉移至幹淨的 1.5 ml
離心管中，即可用于蛋白(bái)濃度測定和後續實驗。
注：如果收集管中有少許沉澱，隻需收集上(shàng)清即可。
三. 懸浮細胞蛋白(bái)提取：
3.1 400 g 4℃ 離心5 min收集細胞；用1 ml 1×PBS重懸細胞，400 g 4℃ 離心5 min收集細胞；重複漂洗細胞一(yī)次；留下(xià)細胞沉澱備用。
3.2 按照(zhào)下(xià)表加入相(xiàng)應體積的變性裂解緩沖液，用移液器(qì)重懸，冰浴處理5分鍾。
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細胞類型
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細胞數量
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細胞沉澱體積（PCV）（μl）
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裂解緩沖液（μl
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懸浮細胞
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1×106
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10
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100
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2×106
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20
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200
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5-10×106
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＞50
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500
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3. 3 将裂解的細胞轉移到(dào)預冷的離心柱中，4℃ 16000g 離心 1分鍾。
注：裂解中細胞會(huì)釋放(fàng)出變性的核酸，呈團狀粘稠透明樣，如移液器(qì)不易吸取，可以将吸頭剪尖，保證将全部裂解物(wù)加到(dào)離心柱中。
3. 4 棄去離心柱，将收集管中蛋白(bái)溶液轉移至幹淨的 1.5 ml
離心管中，即可用于蛋白(bái)濃度測定和後續實驗。
注：如果收集管中有少許沉澱，隻需收集上(shàng)清即可。