His标簽蛋白(bái)純化試劑盒

● 産品簡介：

His标簽蛋白(bái)純化試劑盒（His-tag Protein Purification Kit）也稱為(wèi)鎳柱試劑盒，采用NTA His-tag 純化樹脂可以兼容高(gāo)濃度變性劑(8M尿素或6M鹽酸胍)，能(néng)夠簡單、快速、靈活、高(gāo)效并且高(gāo)特異性地在非變性或變性條件(jiàn)下(xià)純化His标簽蛋白(bái)。純化原理：通(tōng)常帶有6個(gè)組氨酸标簽的重組蛋白(bái)(6X His-tagged recombinant protein)或帶有6個(gè)以上(shàng)連續組氨酸标簽的重組蛋白(bái)，被稱為(wèi)His标簽蛋白(bái)。蛋白(bái)樣品溶液通(tōng)過NTA His-tag 純化樹脂時，重組蛋白(bái)His标簽上(shàng)的組氨酸殘基能(néng)特異性地結合到(dào)樹脂中的鎳離子上(shàng)，其它蛋白(bái)則不能(néng)被結合。洗滌後，His标簽重組蛋白(bái)被洗脫，從(cóng)而被分離純化。

試劑盒配套的NTA His-tag 純化樹脂采用高(gāo)度交聯的6%瓊脂糖凝膠(Sepharose CL-6B)為(wèi)基質，并使用了進一(yī)步優化的連接臂和鎳離子螯合技(jì)術(shù)，非特異性蛋白(bái)結合顯著降低(dī)，耐受壓力強，鎳離子螯合非常穩定。具體參數如下(xià)：

本試劑盒用途廣泛，可以用于在非變性條件(jiàn)和變性條件(jiàn)下(xià)純化His标簽蛋白(bái)。試劑盒配套有蛋白(bái)純化柱，隻需通(tōng)過離心即可完成His标簽蛋白(bái)的結合、漂洗及洗脫步驟，方便快捷。

按照(zhào)每次收集2 ml細菌沉澱，每次使用50 μl NTA His-tag樹脂純化，參考本說明書本試劑盒足夠進行20次的小(xiǎo)量His 标簽蛋白(bái)純化。每次蛋白(bái)(~55kD)的最大純化量為(wèi)0.5-1 mg。

● 貯存及運輸：

4-8℃保存，至少一(yī)年(nián)有效;試劑盒常溫運輸。

● 産品組成：

● 使用說明：

一(yī). 大腸杆菌中His标簽重組蛋白(bái)的誘導表達：

1.1 挑取含His标簽重組蛋白(bái)的單克隆，接種到(dào)10 ml相(xiàng)應抗生(shēng)素的LB培養液中，培養過夜。

1.2 按照(zhào)1:20的比例取培養過夜的菌液，接種到(dào)含相(xiàng)應抗生(shēng)素的LB培養液中。例如取1ml培養過夜的菌液接種到(dào)20ml含适當抗生(shēng)素的LB培養液中。

1.3 37℃常規培養約30-60 min或更長(cháng)時間，至菌液的OD₆₀₀達到(dào)0.6。

   注:OD值非常重要，0.6為(wèi)細菌生(shēng)長(cháng)的對數期。

1.4 加入IPTG至終濃度為(wèi)0.4-1 mM，适當溫度繼續培養4-5小(xiǎo)時。

注：加入IPTG前留取1 ml菌液作為(wèi)未誘導的對照(zhào)。對于特定蛋白(bái)的誘導表達，最佳的IPTG濃度、誘導溫度、和誘導時間需要通(tōng)過實驗确定。

1.5 取2 ml菌液加入到(dào)2 ml離心管中，4℃ 13,000 g離心1min，棄上(shàng)清，收集菌液沉澱。随後即可進入細菌裂解步驟。

注：菌液沉澱也可以在-80oC凍存備用。冷凍保存的菌體使用前需置于冰上(shàng)解凍15 min。

二. His标簽蛋白(bái)的小(xiǎo)量純化：

2.1 裂解：

接步驟1.5，細菌沉澱中加入100 μl 非變性裂解液/變性裂解液，将細菌沉澱充分重懸于裂解液中，可進行輕微的漩渦混勻(盡量避免産生(shēng)氣泡)。

a 裂解液的使用量：

根據His标簽重組蛋白(bái)表達的豐度，菌液和裂解液的體積比可以在25:1-5:1範圍内适當調整。表達豐度非常高(gāo)時，每毫升菌液沉澱可以加入200 μl裂解液；表達豐度非常低(dī)時，每毫升菌液沉澱可以加入40 μl裂解液。

b 非變性裂解液和變性裂解液的選擇：

多(duō)數情況下(xià)應優先選擇非變性條件(jiàn)進行目的蛋白(bái)的裂解，因為(wèi)此條件(jiàn)下(xià)得到(dào)的純化蛋白(bái)是有活性的。如果發現非變性條件(jiàn)目的蛋白(bái)的裂解效果欠佳，但目的蛋白(bái)的表達量能(néng)達到(dào)預期時，首先宜考慮調整目的蛋白(bái)的誘導表達條件(jiàn)，例如調整IPTG等誘導劑的濃度和誘導時的溫度等。如果調整誘導條件(jiàn)後在非變性條件(jiàn)下(xià)仍然裂解效果欠佳，此時再考慮選擇變性條件(jiàn)進行裂解、洗滌和洗脫。變性條件(jiàn)下(xià)使用尿素作為(wèi)變性劑，樣品溶解性好，洗脫樣品無需透析可以直接PAGE檢測，最終純化獲得的目的蛋白(bái)可以通(tōng)過透析去除尿素後複性得到(dào)有活性的蛋白(bái)。

2.2 可選步驟：

加入終濃度1 mM PMSF或蛋白(bái)酶抑制劑混合物(wù)，混勻。

    注:蛋白(bái)酶抑制劑能(néng)防止蛋白(bái)降解。

2.3 酶解：

加入終濃度1 mg/ml溶菌酶并輕輕混勻，盡量避免産生(shēng)氣泡，冰水(shuǐ)浴或冰上(shàng)放(fàng)置30min。

注：溶菌酶根據标簽指示用滅菌水(shuǐ)配制成100 mg/ml的母液，現用現加。溶菌酶配制成母液後，可以适當分裝後-20℃保存。

2.4超聲：

冰上(shàng)超聲裂解細菌。超聲功率200-300 W，每次超聲處理10 s，每次間隔10 s，共超聲處理6-10次。具體超聲處理的方式須根據特定型号的超聲儀器(qì)自(zì)行摸索和優化。

注：此步驟非常重要，如果超聲不徹底，His标簽蛋白(bái)不能(néng)有效釋放(fàng)，會(huì)導緻大量目的蛋白(bái)在步驟2.5離心後會(huì)留在沉澱中，導緻蛋白(bái)純化效率大大降低(dī)。

2.5 離心得到(dào)上(shàng)清：

4℃ 13000 rpm 離心10 min，收集上(shàng)清至1.5ml離心管中，取10 μl上(shàng)清留樣作後續檢測用。待純化的His标簽蛋白(bái)即在上(shàng)清中。

2.6 蛋白(bái)純化柱裝配：

2.6.1 蛋白(bái)純化空柱（純化空柱放(fàng)入2 ml收集管中）中加入50 μl NTA His-tag樹脂，旋緊蓋子，擰掉柱子底部的連接。4℃ 2000 rpm 1分鍾，棄收集管内溶液。

注：轉速不要高(gāo)于2000 rm，高(gāo)轉速容易損傷樹脂。

2.6.2 純化柱中加入500 μl非變性裂解液/變性裂解液，旋緊蓋子，4℃ 2000 rpm 1分鍾，棄收集管内溶液；

2.6.3 重複2.6.2步驟一(yī)次。

注：此兩個(gè)步驟是用緩沖液平衡樹脂，可以有效提高(gāo)蛋白(bái)純化效率。

2.7 樹脂螯合His标簽蛋白(bái)：

2.7.1将紅(hóng)色堵頭安裝在純化柱下(xià)端突起上(shàng)，純化柱中加入步驟2.5得到(dào)的上(shàng)清（約80-90 μl），旋緊蓋子。4℃ 搖床搖動30分鍾，使蛋白(bái)和樹脂充分結合。

注：樹脂和蛋白(bái)結合可以混合更長(cháng)時間，可以過夜處理。

2.7.2 拔掉紅(hóng)色堵頭，将純化柱放(fàng)入2 ml收集管中，旋緊蓋子，4℃ 2000 rpm 1分鍾。

注：建議保留流穿液待檢，檢測樹脂的結合能(néng)力。

2.8 漂洗：

2.8.1 純化柱内加入500 μl 非變性漂洗液/變性漂洗液，4℃ 2000 rpm 1分鍾，棄收集管内溶液。

2.8.2 重複2.8.1步驟再次漂洗一(yī)次。

2.9 洗脫：

2.9.1 将純化柱轉移到(dào)一(yī)幹淨1.5 ml離心管中，加入30-50 μl非變性洗脫液，輕彈混勻，4℃ 2000 rpm 1分鍾，1.5ml離心管内即為(wèi)純化的目的蛋白(bái)；

2.9.2重複2.9.1再次洗脫一(yī)次。

2.10 收集：

收集兩次洗脫液即為(wèi)純化的目的蛋白(bái)，-20℃或-80℃貯存。

● 實驗示例：

非變性條件(jiàn)下(xià)His-tag蛋白(bái)純化

電(diàn)泳條件(jiàn)：1×TGS，4-20% RealPAGE Precast Gel 150V 60min

M1：RTD6105 雙色預染寬分子量蛋白(bái)Marker（10-170 kD）

M2：RTD6111 寬分子量蛋白(bái)Marker（10-200 kD）

未誘導對照(zhào)（步驟1.4）；IPTG誘導對照(zhào)（步驟1.6 ）；

               離心後上(shàng)清（步驟3.5 ）；流穿液FT（步驟3.7.2）； 

               漂洗液1 （W1）（步驟3.8.1 ）；漂洗液2 （W2）（步驟3.8.2 ）；

               洗脫液1（E1）（步驟3.9.1）； 洗脫液2（E2）（步驟3.9.2）