動物(wù)線粒體提取試劑盒（細胞樣品）

          (Animal Cell Mitochondria Isolation Kit)     

● 産品簡介

動物(wù)細胞線粒體提取試劑盒(Animal Cell Mitochondria Isolation Kit)可以快速便捷分離培養細胞的線粒體。試劑盒的緩沖系統不含任何表面活性劑和螯合劑EDTA，分離獲得的線粒體純度較高(gāo)，并且絕大部分分離獲得的線粒體都含有完整的内膜和外膜，可以用于線粒體的生(shēng)理功能(néng)等方面的研究。另外，優化的裂解配方配套離心柱法有效裂解細胞，省去了經典方法使用玻璃勻漿器(qì)的繁瑣操作，更加省時省力。同時，本試劑盒在分離線粒體的同時可以獲得去除線粒體的細胞胞漿蛋白(bái)，可以研究線粒體蛋白(bái)向胞漿内的運輸機(jī)制。

該産品約30分鍾即可完成培養細胞線粒體的提取。線粒體是在溫和、非變性條件(jiàn)下(xià)提取的，結合不同的溶解液，溶解後的線粒體可以用于SDS-PAGE變性電(diàn)泳檢測、Blue Native非變性電(diàn)泳檢測以及等電(diàn)聚焦電(diàn)泳等。另外，提取的線粒體具有生(shēng)理功能(néng)，可以用于線粒體的生(shēng)理功能(néng)等方面的研究。

按照(zhào)每次提取2×10⁷細胞計算(suàn)，試劑盒可以使用大約50次。

● 産品組成

● 貯存條件(jiàn)和運輸：

按照(zhào)标簽溫度貯存；有效期一(yī)年(nián)；濕冰運輸。

● 用前必讀(dú)：

1. 離心機(jī)請調整成RCF/g模式，按照(zhào)離心力設置離心機(jī)（不要根據轉速rpm模式設置），所有離心步驟都需要在4℃低(dī)溫離心機(jī)中進行。

2. 将分離緩沖液A，分離緩沖液B，漂洗緩沖液和貯存緩沖液混勻後放(fàng)置于冰上(shàng)。将離心柱套入2 ml連蓋收集管中，蓋好管蓋，放(fàng)置于冰上(shàng)預冷。

3. 蛋白(bái)提取推薦添加蛋白(bái)酶抑制劑（自(zì)備，試劑盒不提供），根據蛋白(bái)酶抑制劑母液濃度提前添加在膜蛋白(bái)提取溶液中（如抑制劑母液是 100×，添加時按照(zhào)1:100添加，即1ml膜蛋白(bái)提取溶液添加10μl抑制劑）。研究蛋白(bái)磷酸化，需要添加磷酸酶抑制劑（自(zì)備，試劑盒不提供）。

4. 蛋白(bái)定量推薦使用BCA方法，可以選擇BCA蛋白(bái)濃度測定試劑盒（貨号：RTP7102）。

● 使用方法：

一(yī). 準備溶液：

常溫溶解試劑盒中的各種溶液，溶解後立即置于冰上(shàng)并混勻。如果最終實驗目的是制備線粒體蛋白(bái)樣品，根據樣品數量，取适量體積分離緩沖液A加入蛋白(bái)酶抑制劑。按照(zhào)下(xià)表大體估算(suàn)分離緩沖液A的使用體積：

注:(二百萬，2×10⁶)HeLa細胞，其細胞沉澱體積（PCV，Packed Cell Volume）大約為(wèi)20 μl。

二. 收集細胞：

2.1 對于貼壁細胞：細胞用PBS漂洗一(yī)遍，棄PBS；再加入适量PBS，用細胞刮刀刮下(xià)細胞，或用0.02% EDTA（0.5 mM）溶液處理細胞使細胞不再貼壁很緊，并用移液器(qì)吹打下(xià)細胞。400 g（~2000 rpm） 4℃離心5 min收集細胞，盡最大努力吸盡上(shàng)清，留下(xià)細胞沉澱備用。盡量避免用胰酶消化細胞，以免胰酶降解需提取的目的蛋白(bái)。

2.2 對于懸浮細胞：400 g（~2000 rpm）4℃離心5 min收集細胞，用PBS洗一(yī)遍，離心收集細胞，盡最大努力吸盡上(shàng)清，留下(xià)細胞沉澱備用。

三. 裂解細胞膜：

3.1細胞沉澱中加入250 μl準備好的分離緩沖液A（含蛋白(bái)酶抑制劑），用移液器(qì)吹打重懸細胞沉澱，渦旋劇烈震蕩30-60秒(miǎo)，冰浴處理10分鍾，間歇2-3混勻。

注：建議将起始細胞數不要低(dī)于2×10⁷，否則将導緻最後線粒體得率過低(dī)。

3.2 将細胞懸液轉移到(dào)離心柱中，蓋上(shàng)管蓋，16,000 g（~13000 rpm） 4℃離心1分鍾，離心後收集管底部會(huì)有沉澱形成。

     注：離心柱最大體積為(wèi)600 μl；确保離心機(jī)可以在10秒(miǎo)内達到(dào)16000 g。

3.3 棄去離心柱，蓋好2 ml收集管管蓋，用1ml移液器(qì)輕柔吹打重懸收集管中的沉澱。

四. 去除細胞核和未破碎的細胞：

溶液700 g（~2700 rpm） 4℃離心1分鍾，用200 μl吸頭小(xiǎo)心将上(shàng)清（上(shàng)清稍有渾濁）轉移到(dào)新的1.5 ml離心管中。注意：轉速不要超過700g，否則會(huì)降低(dī)線粒體的得率。

關鍵步驟：吸取上(shàng)清時不要觸及沉澱，甚至可以丢棄部分上(shàng)清不吸取，以免上(shàng)清（含線粒體）中污染核蛋白(bái)。如果使用250 μl分離緩沖液A，建議吸取200 μl上(shàng)清。此步驟得到(dào)的細胞核純度不高(gāo)，混雜(zá)有沒有完全破碎的完整細胞，不建議用于相(xiàng)關實驗。

五. 收集線粒體：

5.1 上(shàng)清中加入等體積的分離緩沖液B（如步驟4吸取200 μl上(shàng)清，則加入200 μl分離緩沖液B），混勻；

5.2 16000 g（~13000 rpm） 4℃離心10分鍾，用200 μl吸頭吸去上(shàng)清，沉澱即為(wèi)提取的線粒體。上(shàng)清是胞漿蛋白(bái)，如需要可保存備用。

關鍵步驟：此步驟必須完全将上(shàng)清吸取幹淨，可以用200μl吸頭分次吸取上(shàng)清，最後用10 μl吸頭将殘餘上(shàng)清徹底吸淨，以免線粒體中污染胞漿蛋白(bái)。

六. 線粒體漂洗：

   線粒體沉澱中加入0.5 ml 漂洗緩沖液，輕柔重懸沉澱，16,000 g，4℃離心5分鍾，棄上(shàng)清，沉澱即為(wèi)漂洗後的線粒體。

七. 線粒體的使用：

7.1 線粒體功能(néng)研究：

如果用于完整線粒體的功能(néng)或酶活性研究，初始2×10⁷細胞分離得到(dào)的線粒體樣品中加入100-150 μl線粒體貯存緩沖液，重懸線粒體後-80℃備用。不建議長(cháng)期貯存，盡快使用。

7.2 線粒體蛋白(bái)電(diàn)泳：

7.2.1線粒體蛋白(bái)變性樣品處理：

7.2.1.1 初始2×10⁷細胞分離得到(dào)的線粒體沉澱中建議使用50 μl變性蛋白(bái)溶解液（貨号：PS1020）溶解線粒體沉澱；

7.2.1.2 BCA方法測定蛋白(bái)濃度（貨号：RTP7102）；

7.2.1.3用變性蛋白(bái)溶解液調整蛋白(bái)濃度為(wèi)1 μg/μl，按需分裝，每管50 μl，-80℃保存待用；

7.2.1.4取一(yī)管50 μl樣品加入SDS-PAGE上(shàng)樣緩沖液（貨号：PL080，PL113，PL121）處理，建議調整上(shàng)樣液濃度為(wèi)0.5 μg/μl；對于多(duō)次跨膜蛋白(bái)（Multi-pass membrane protein）的變性電(diàn)泳檢測，樣品建議使用37℃處理30分鍾，不要95℃加熱5分鍾，因為(wèi)在95℃高(gāo)溫情況下(xià)，多(duō)次跨膜蛋白(bái)極易聚集形成多(duō)聚體，樣品會(huì)聚集，WB檢測會(huì)表現為(wèi)比實際蛋白(bái)大小(xiǎo)更大的分子量；

7.2.1.5 使用SDS-PAGE凝膠（貨号：RTD6132，RTD6116）電(diàn)泳，每個(gè)泳道上(shàng)樣10-40 μl（5-20 μg）。

7.2.2 線粒體蛋白(bái)BN非變性樣品處理：

7.2.2.1 初始2×10⁷細胞分離得到(dào)的線粒體沉澱中建議使用50 μl膜蛋白(bái)重懸液（BN電(diàn)泳用）（貨号:PN1020）重懸線粒體沉澱；

7.2.2.2 BCA方法測定蛋白(bái)濃度（貨号：RTP7102）；

7.2.2.3 用膜蛋白(bái)重懸液（BN電(diàn)泳用）（貨号：PN1020）調整蛋白(bái)濃度為(wèi)1 μg/μl，按需分裝，每管50 μl，-80℃保存待用；

7.2.2.4 取一(yī)管50 μl樣品，溶化混勻後4℃ 16000 g 5分鍾，去除上(shàng)清，保留沉澱；

7.2.2.5 沉澱中加入50 μl膜蛋白(bái)增溶液A（貨号：DM1080），輕柔重懸沉澱，盡量不産生(shēng)氣泡，冰浴10分鍾；

7.2.2.6 4℃ 16000 g 15分鍾，取上(shàng)清至一(yī)幹淨1.5 ml離心管中即為(wèi)增溶後線粒體蛋白(bái)溶液（小(xiǎo)心不要吸取沉澱），此時得到(dào)的線粒體蛋白(bái)濃度為(wèi)1 μg/μl，其中去垢劑DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM， n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）終濃度為(wèi)1%；

7.2.2.7 線粒體蛋白(bái)溶液中加入1/10體積10×膜蛋白(bái)A型上(shàng)樣緩沖液（配套膜蛋白(bái)增溶液A使用）（貨号：PL130），使用BN凝膠電(diàn)泳（貨号：RTD6139，RTD6140），每個(gè)泳道上(shàng)樣5-20 μg。

7.2.3 線粒體蛋白(bái)等電(diàn)聚焦樣品處理（2D凝膠第一(yī)維電(diàn)泳）：

建議線粒體沉澱中使用溶解液：7 M尿素,2 M硫脲, 2%CHAPS,20 mM DTT(自(zì)備，試劑盒不提供)。

八 線粒體産量和質量的評價：

8.1 線粒體産量：

8.2 線粒體質量評價：

線粒體質量評價首先看(kàn)提取的線粒體是否具有完整的内外膜結構（進行線粒體功能(néng)活性研究），其次要看(kàn)裂解後的線粒體蛋白(bái)是否有明顯的富集，其三要看(kàn)裂解後的線粒體蛋白(bái)是否有其他組分交叉污染，最後看(kàn)提取的線粒體中是否可以檢測出目的蛋白(bái)。使用專門(mén)的線粒體内參檢測（下(xià)表），可以初步确認提出的是線粒體蛋白(bái)。線粒體蛋白(bái)是否有效富集需要用總蛋白(bái)作為(wèi)對照(zhào)，與總蛋白(bái)相(xiàng)比，線粒體内參蛋白(bái)是否有明顯富集。線粒體蛋白(bái)中的交叉污染可以用其他組分内參檢測線粒體蛋白(bái)樣品，如關注線粒體蛋白(bái)中是否有胞漿蛋白(bái)污染，可以使用胞漿蛋白(bái)内參檢測線粒體蛋白(bái)，檢測條帶的強弱即說明線粒體蛋白(bái)與胞漿蛋白(bái)交叉污染的程度。用目标蛋白(bái)抗體檢測線粒體蛋白(bái)，驗證是否可以檢測到(dào)目的蛋白(bái)，蛋白(bái)大小(xiǎo)是否符合預期。

許多(duō)研究人員(yuán)利用 WB對分離的線粒體蛋白(bái)進行純度檢測，經常發現一(yī)些常用的胞漿内參能(néng)在線粒體蛋白(bái)中檢測到(dào)，例如β-actin^[1], GAPDH ^[2] 和 β-tubulin，這是由于這些胞漿内參不僅存在于胞漿也存在于線粒體中，因此可以在線粒體蛋白(bái)中檢測到(dào)胞漿内參。更多(duō)信息，請參閱以下(xià)論文：

1 Hatch, Anna L., Pinar S. Gurel, and Henry N. Higgs. Novel roles for actin in mitochondrial fission. Journal of Cell Science (2014) 127, 1–12

2 Zhang, Jin-Ying, et al. Critical protein GAPDH and its regulatory mechanisms in cancer cells. Cancer Biol Med 2015;12:10-22.

九 實驗示例：

不同去垢劑處理K562細胞線粒體3-12%BN電(diàn)泳